CRISPR/Cas9 基因编辑哺乳动物细胞

日期: 2017年12月31日


    

导读:本文主要介绍构建好的CRISPR/Cas9系统如何在细胞中工作和后续如何筛选编辑成功的永久细胞系。下面,赛业小编为您推荐“CRISPR/Cas9 基因编辑哺乳动物细胞”,详情如下:


本文主要介绍构建好的CRISPR/Cas9系统如何在细胞中工作和后续如何筛选编辑成功的永久细胞系。


以pSpCas9-2A-Puro(PX459)即sgRNA, Cas9共表达质粒为例:


Sanger测序确定sgRNA 成功插入PX459质粒后(见下图),将构建好的PX459质粒转染到细胞中,根据自己所编辑的细胞类型选择质粒转染方式。常见的转染方式有电转或脂质体转染(lip2000或lip3000就可以解决大部分细胞的转染问题了)。转染的时候记得用表达荧光基因的质粒作为对照,排除后续实验中基因未被编辑是由于转染的问题所导致的。

  

Fig 1 Construction of sgRNA-co
Fig 1 Construction of sgRNA-co


PX459质粒具有puromysin抗性,因此转染后,用puromysin 筛选至空白对照无细胞存活为止。一部分细胞提取基因组DNA(gDNA),一部分细胞继续培养。以NCBI(UCSC, Ensemble等都可以)基因组DNA序列为模板设计引物,引物位于sgRNA target 位置上下游各200-300左右。以提取的gDNA为模板,PCR扩增, 得到400-600左右的PCR产物。凝胶电泳检测PCR产物特异性。若PCR产物为单一条带,送去sanger 测序,测序引物即为PCR引物。若出现杂带,则重新设计特异性强的引物,或者提高退火温度,后者部分情况有效。


测序结果分析,若sgRNA target区域及附近序列出现套峰(见下图),则表明sgRNA 工作。接下来建立永久细胞系。将上述puromysin筛选后继续培养的细胞进行梯度稀释,得到单个细胞后继续培养,提取gDNA, PCR, sanger测序, 选择所需被编辑的细胞,如基因敲除或者精确编辑如单碱基编辑等。

  

sgRNA target区域及附近序列出现套峰


注意事项:


1. 由于整个流程时间较长,因此,首先要确认sgRNA是否具有活性,即先将sgRNA,Cas9导入工具细胞中(容易转染,细胞周期较短,容易培养,如HEK293T细胞),puromysin筛选后提取群体细胞gDNA进行PCR、测序,确定细胞基因组DNA能被编辑后,再在目的细胞株如神经细胞中进行编辑,特别是做基因编辑的动物模型,这一步必不可少。如果目的细胞株比较容易培养、转染,就不需要利用工具细胞进行预实验了。若做精确编辑,转染时需要将同源修复模板与sgRNA-Cas9 表达质粒一起导入细胞。


2. Puromysin 筛选时,需筛至空白对照孔中的细胞绝大多数死亡,恢复培养一天后即可提取gDNA进行下一步,利于后续被编辑的单克隆细胞的挑选。


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