CRISPR/Cas9 基因编辑哺乳动物细胞

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本文主要介绍构建好的CRISPR/Cas9系统如何在细胞中工作和后续如何筛选编辑成功的永久细胞系。

以pSpCas9-2A-Puro（PX459）即sgRNA, Cas9共表达质粒为例：

Sanger测序确定sgRNA 成功插入PX459质粒后（见下图），将构建好的PX459质粒转染到细胞中，根据自己所编辑的细胞类型选择质粒转染方式。常见的转染方式有电转或脂质体转染（lip2000或lip3000就可以解决大部分细胞的转染问题了）。转染的时候记得用表达荧光基因的质粒作为对照，排除后续实验中基因未被编辑是由于转染的问题所导致的。

Fig 1 Construction of sgRNA-co

PX459质粒具有puromysin抗性，因此转染后，用puromysin 筛选至空白对照无细胞存活为止。一部分细胞提取基因组DNA（gDNA），一部分细胞继续培养。以NCBI（UCSC, Ensemble等都可以）基因组DNA序列为模板设计引物，引物位于sgRNA target 位置上下游各200-300左右。以提取的gDNA为模板，PCR扩增， 得到400-600左右的PCR产物。凝胶电泳检测PCR产物特异性。若PCR产物为单一条带，送去sanger 测序，测序引物即为PCR引物。若出现杂带，则重新设计特异性强的引物，或者提高退火温度，后者部分情况有效。

测序结果分析，若sgRNA target区域及附近序列出现套峰（见下图），则表明sgRNA 工作。接下来建立永久细胞系。将上述puromysin筛选后继续培养的细胞进行梯度稀释，得到单个细胞后继续培养，提取gDNA, PCR, sanger测序, 选择所需被编辑的细胞，如基因敲除或者精确编辑如单碱基编辑等。

注意事项：

1. 由于整个流程时间较长，因此，首先要确认sgRNA是否具有活性，即先将sgRNA，Cas9导入工具细胞中（容易转染，细胞周期较短，容易培养，如HEK293T细胞），puromysin筛选后提取群体细胞gDNA进行PCR、测序，确定细胞基因组DNA能被编辑后，再在目的细胞株如神经细胞中进行编辑，特别是做基因编辑的动物模型，这一步必不可少。如果目的细胞株比较容易培养、转染，就不需要利用工具细胞进行预实验了。若做精确编辑，转染时需要将同源修复模板与sgRNA-Cas9 表达质粒一起导入细胞。

2. Puromysin 筛选时，需筛至空白对照孔中的细胞绝大多数死亡，恢复培养一天后即可提取gDNA进行下一步，利于后续被编辑的单克隆细胞的挑选。

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