Nature Biotechnology发表CRISPR新成果: 针对长链非编码RNA的完全敲除高通量筛选

日期: 2018年11月07日


    

前言:作为强大的基因编辑工具,CRISPR/Cas9系统能够在蛋白编码基因的外显子区域产生移码突变而彻底破坏蛋白表达及功能,这一特性被广泛应用于基因的大规模功能性筛选研究。人类基因组中除了蛋白编码基因,绝大多数区域为非编码序列。其中长链非编码RNA(lncRNA)已有上万个位点被注释,但是它们绝大多数功能未知,一些已知功能的lncRNA与癌症等很多疾病的发生发展密切相关。

 

来自北京大学生命科学学院的研究人员发表了题为“Genome-wide screening for functional long noncoding RNAs in human cells by Cas9 targeting of splice sites”的论文,构建了特异性靶向基因的剪接位点的新型CRISPR文库,以高通量的方式产生基因的外显子缺失或者内含子滞留。首次真正实现了从全基因组水平对长链非编码RNA进行基于完全敲除的高通量筛选,该方法学将为系统发现和解析lncRNA功能提供有效的工具。

 

这一研究成果公布在11月5日Nature Biotechnology杂志上,由北京大学生命科学学院魏文胜教授领导完成,文章第一作者为刘莹、曹中正、王轶楠以及郭昱。

 

之前,魏文胜课题组与合作者之前率先建立了通过成对gRNA(pgRNA)在基因组中产生大片段删除的策略来对lncRNA进行高通量功能性筛选(Zhu et al. Nature Biotechnol 2016)。后续又有报道通过CRISPRi(Liu et al. Science 2017)以及CRISPRa(Joung et al. Nature 2017)等方法来进行lncRNA的高通量功能性筛选。

 

但这些方法在效率、质量(假阳性、假阴性)上各有欠缺:比如CRISPRi的方法只能实现基因表达抑制而不是完全敲除,CRISPRa的方法只能上调基因表达,无法对基因不可或缺的作用实施筛选评估。大片段删除的策略由于步骤的繁琐,也限制了其在更大规模上得到应用。

 

为了突破以上方法上的局限,魏文胜研究组设计了新的筛选策略,构建了特异性靶向基因的剪接位点的新型CRISPR文库,以高通量的方式产生基因的外显子缺失或者内含子滞留。运用这一策略,实现了全基因组水平上对于lncRNA功能的高效筛选。【CRISPR-AI cKO小鼠精子库现货库存,超 600品系,仅需4.68万!】---现货条件性基因敲除小鼠!点击了解详情

 

研究人员利用靶向10,996个 lncRNA的特殊CRISPR文库,在慢性髓性白血病细胞K562中筛选并发现了230个 lncRNA与细胞存活或增殖相关。在HeLa细胞以及人B淋巴细胞GM12878中则分别发现了115个及220个影响细胞存活与增殖的lncRNA。进一步分析表明,lncRNA功能在不同细胞种类中具有显著异质性。

 

这一新型高通量技术平台的建立,首次真正实现了从全基因组水平对长链非编码RNA进行基于完全敲除的高通量筛选,该方法学将为系统发现和解析lncRNA功能提供有效的工具。

 

lncRNA功能

 

(a) 真核生物(人)剪接位点区域的基因组序列特征和碱基特异性。(b) 靶向剪接位点的长非编码RNA的功能性筛选策略。(c) K562细胞中影响细胞存活与增殖的lncRNA筛选结果。(赛业生物 www.cyagen.com)

 

原文标题:

Genome-wide screening for functional long noncoding RNAs in human cells by Cas9 targeting of splice sites

https://www.nature.com/articles/nbt.4283

 

转载标题:Nature Biotechnology发表CRISPR新成果:针对长链非编码RNA的完全敲除高通量筛选

 

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作为实力雄厚的基因工程鼠技术平台,赛业生物已服务全球数万名科学家,赛业产品与技术已直接应用于包括CNS(Cell, Nature, Science)三大期刊在内的2030篇学术论文。2016年,TurboKnockout把 ES打靶金标准推向新高度;同年,CRISPR-Pro使大片段敲入及条件性基因敲除变得更加高效;2017年,AlphaKnockout基因打靶专家系统首次实现基于人工智能的最优化方案设计;同年7月,推出万例CRISPR-AI敲除小鼠资源库。赛业一步一个脚印,踏实前行,助力中国科研!

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