对付难转染的细胞,现在你有了更多工具

日期: 2018年11月30日


    

转染是细胞生物学中最基本的操作之一。有意思的是,转染(transfection)这个术语最初是用来形容通过病毒感染发生的基因转移,不过,这个过程现在被称为转导(transduction)。如今,转染指的是非病毒介导的基因转移,包括siRNA、miRNA、大的RNA和DNA。

 

最常见的转染方法包括阳离子脂质、高分子聚合物或脂质体,它们包裹带负电的核酸并将它们运送至细胞。转染试剂中和了基因与细胞膜之间的静电排斥,并帮助复合物突破细胞膜的物理屏障。内吞作用往往依赖于细胞表面受体对转染复合物的识别。

 

转染本不易

 

转染过程虽然原理简单,但结果往往不尽如人意。转染的优化需要密切监视整个过程,从转染方法的选择到蛋白质的表达。这一路需要考虑多个因素,包括细胞类型,核酸从内体到功能位点的转运,DNA的核转运,以及转染/蛋白表达对细胞健康的影响。

 

然而,大多数因素都由细胞本身来控制,而不受我们的控制。因此,我们能够掌控的只是如何将转染复合物导入细胞。作为化学转染的替代,机械方法也开始出现。这些方法包括电穿孔、显微注射、基因枪或磁性辅助转染,具体取决于细胞类型和应用。

 

当然,基于试剂的化学转染方法仍然是转染的主流,因为这种方法简单易行,适用于广泛的细胞类型。目前,各大公司都提供商业化的转染试剂,比如大家耳熟能详的Lipofectamine系列和Fugene系列。

 

“转染复合物的组成和物理性质对于成功转移基因至关重要,”Mirus Bio公司的全球销售经理Miguel Dominguez谈道。“目前非传统细胞系被普遍使用,包括原代细胞干细胞,这些细胞可能不容易掺入转染复合物,这就强调了转染优化的重要性。”

 

对付难转染的细胞

 

机械转染方法的出现,在很大程度上是为了对付难转染的细胞。例如,OZ Biosciences的旗舰产品Magnetofection™平台,就是专为干细胞和原代细胞而开发的,如神经元、内皮细胞和小胶质细胞。

 

OZ Biosciences的业务经理Romuald Arnaud表示:“基因进入细胞的机制涉及到细胞表面受体,它们会抓住脂质体试剂,引发受体-复合物的相互作用和内化。容易转染的细胞上覆盖了这些受体,并具有其他必需的特征,如快速分裂,高内吞作用和高代谢活性。”

 

不过,干细胞和未定型的祖细胞等不成熟的细胞上缺乏这些特征。同样地,原代细胞不分裂,内化能力比较低,并且往往缺乏与转染复合物结合的能力。然而,它们却是药物发现、毒理学和基础研究中的关键模型。

 

转染困难户不仅仅限于不成熟细胞或原代细胞。HeLa细胞在使用化学方法转染时,也难以达到高转染效率,因为培养很久或多次转染的细胞系也可能耐受转染。“培养物年龄、汇合度和传代次数等因素造成它们难以转染,”Arnaud补充说。

 

Magnetofection是一种机械转染方法。它利用涂有阳离子的金属纳米颗粒,通过静电和疏水作用与核酸发生相互作用,进而将转染复合物导入细胞,而不会对细胞造成损伤。转染复合物与细胞松散地结合,但是通过培养皿下方的磁铁作用被拉到细胞表面上,并最终内化。

 

与基因枪等机械技术相比,Magnetofection不会给细胞膜带来损伤。“强迫内化虽然有效,但细胞死亡率极高,”Arnaud解释道。“Magnetofection让细胞在最小的应激状态下内化转染复合物,导入高水平的核酸,从而获得更多的转基因表达机会。”

 

Magnetofection及机械方法的另一个优势在于一致性。一旦针对基因掺入、蛋白产量等方面优化好,这些转染条件就很容易重复,帮助人们获得相同的结果。

 

尝试小体积转染

 

我们对转染方法的优化,不仅仅能够带来更高的蛋白产量和表达,也能够减少DNA和转染试剂的用量。Promega利用ViaFect™转染试剂开发出一种实验方案,能够形成更小体积的转染复合物。据介绍,对于HEK293等细胞系来说,小体积转染带来更高的转染效率,并减少试剂用量,维持细胞健康。

 

Promega的科学应用经理Brad Hook解释了小体积转染的好处:“在加入试剂之前,我们没有按照往常那样对DNA进行100倍的稀释,而是进行25倍的稀释,然后加入试剂并孵育。对于某些细胞系而言,如HEK293,这种方法明显提高了转染效率。对于其他细胞系,小体积转染在维持转染效率的同时减少了转染试剂的用量。”

 

Hook还指出,尽管转染试剂的供应商通常都提供特定细胞系的最佳转染条件,但这些数据通常仅供参考。

 

“为了让自己实验室的细胞达到最佳的转染效率,优化往往是必需的。每个实验室的传代次数和细胞健康状态都不同,这会影响转染效率。评估细胞健康也是至关重要的,因为转染过程所造成的毒性会明显影响下游的分析。让转染效率达到最高同时让细胞保持健康的转染条件才是理想的,”他说。(赛业生物 www.cyagen.com

 

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【赛业生物科技简介】

 

作为实力雄厚的基因工程鼠技术平台,赛业生物已服务全球数万名科学家,赛业产品与技术已直接应用于包括CNS(Cell, Nature, Science)三大期刊在内的2030篇学术论文。2016年,TurboKnockout把 ES打靶金标准推向新高度;同年,CRISPR-Pro使大片段敲入及条件性基因敲除变得更加高效;2017年, AlphaKnockout基因打靶专家系统首次实现基于人工智能的最优化方案设计;同年7月,推出万例CRISPR-AI敲除小鼠资源库。赛业一步一个脚印,踏实前行,助力中国科研!

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