基因修饰小鼠(GEM)模型在肿瘤学研究中的应用

日期: 2018年07月20日


    

作者:俞晓峰 博士 赛业模式动物高级副总裁、高级科学家

 

前言

 

    

相对于过去常用的肿瘤细胞接种和免疫缺陷小鼠模型,基因修饰小鼠(GEM)模型是建立在天然完整免疫条件下的原发(de novo)肿瘤。因此,作为肿瘤学研究的工具,GEM模型更能模拟人肿瘤的组织病理学和分子学特征,表现为有更好的遗传异质性,其优势在于能反映肿瘤细胞自身,以及肿瘤微环境中细胞等相互作用因素,包括具有引起原发肿瘤开始形成到发展为转移性疾病的能力。GEM模型的建立及应用极大促进了肿瘤学研究领域的发展与进步。目前,GEM模型已成功应用于验证潜在肿瘤基因与药物靶点,考核治疗效果,分析肿瘤微环境影响,以及评价药物耐药性机制等研究领域。而且,结合临床病人研究与构建更加合理有效的GEM模型,优化肿瘤干预的临床前试验,无疑将进一步促进肿瘤治疗新策略的研发,提高其有效转化为临床上实际应用的成功率。

    

目前肿瘤学研究面临的主要挑战

 

 

肿瘤学研究及肿瘤治疗在临床上仍然面临着许多挑战,其中抗肿瘤药物耐受性的形成和肿瘤转移性疾病是当前面临的两个重要现实难题。抗肿瘤耐药性的产生是由于异质性肿瘤中的原发突变的出现,或治疗前耐药克隆的大量生长引起的,而现有靶向抗肿瘤制剂的单一疗法,或化学药物疗法都无法避免药物耐受的发生。而且,在获得明显成功治疗之后,少量药物耐受肿瘤细胞可以存活下来,并在一定时间后,成为主要细胞群,最终形成与原始肿瘤表型不同的复发疾病。而肿瘤转移性疾病则是导致90%以上与癌症相关死亡的原因,因为现在对于这些继发肿瘤也多无有效的治疗方法。近年来,虽然针对干预肿瘤病人免疫系统的肿瘤免疫疗法取得了一些令人鼓舞的进展,但该疗法也只是在一些特定病例情况下有效果,而对于大多数肿瘤病人仍不具有实际临床意义。

 

所谓成功的肿瘤治疗往往需要多种方法的协同作用,比如手术,放射线照射,细胞毒性疗法,以及免疫疗法等综合策略。为了设计出有效合理的综合治疗措施与方案,首要的基础与前提是深入了解肿瘤的形成与发展,转移,及治疗应答过程中,肿瘤细胞自身及其微环境细胞间相互作用的机制,从而寻找针对不同肿瘤类型最有效的治疗方法。为了实现这一目的,研究者们就必须依赖于动物模型的临床前研究。尽管过去依赖于传统临床前小鼠模型(即通过建立移植人肿瘤细胞系或同种小鼠肿瘤细胞系模型等方法)获得了临床前抗癌新疗法的成功验证,但绝大多数的这些新疗法在临床III期试验中却都以失败而告终。

 

总体上讲,由于传统体内肿瘤小鼠模型在预测临床新疗法效果方面的表现不佳,因而更加凸显出寻找具有更好预测能力及效果的改进型临床前体内模型的意义与价值。最近在基因修饰技术方面的进步与发展,使得快速研制能更有效模拟人肿瘤的GEM模型成为现实,GEM模型在遗传组成,肿瘤细胞与其肿瘤微环境的相互作用,药物反应及耐受等方面都更接近肿瘤病人。而新一代GEM模型的出现,也大大促进抗肿瘤新疗法策略转化为临床应用,最终达到提高癌症病人生存率的目的。

 

肿瘤学研究中常用传统小鼠模型的优势与不足

  

 

 

50年前首先在裸鼠体内移植人/鼠肿瘤细胞系而建立的小鼠肿瘤移植模型成为肿瘤研究中常用的小鼠模型,这类移植模型可快速测试潜在肿瘤及转移相关基因,并成为临床前的药物试验主要工具。例如,通过异种移植研究有助于揭示结肠癌(CRC)对药物(如Vemurafenib)在小鼠体内的耐受机制,从而实现在临床试验中对CRC病人启动同时针对突变BRAF(如V600E)和EGFR的靶向联合疗法,表明这类异种移植模型在建立新的联合治疗策略方面的实际意义。

  

异种移植研究也有助于发现特定基因表达特征,研究其介导的器官特异性定位转移的特点。如应用该种模型证实了传播的乳腺癌细胞存在于血管附近,这为调控这些传播的乳腺癌细胞提供了可能的对策。而且,应用肿瘤细胞系移植的体内模型研究,也为抗肿瘤免疫,T细胞耐受机制,肿瘤免疫逃逸途径等提供了许多基本的认识概念。这些发现都为目前进行中的肿瘤免疫疗法的突破奠定了基础。

  

然而,由于肿瘤细胞系一开始就含有许多突变,而且在体外长时间培养过程中,还会产生额外突变,因此,此类接种模型难以真实反映人肿瘤细胞的形态学和遗传异质性,从而降低了该类模型作为临床应用效果预测性的可靠性。另外,为了防止可能的排斥反应,肿瘤细胞系的异种移植模型是建立在免疫缺陷小鼠基础上,这也限制了其应用于肿瘤发展中免疫系统以及治疗应答等领域的研究。

  

不同于细胞系移植模型,通过将新鲜人肿瘤活检物移植至免疫缺陷小鼠构建的病人来源的肿瘤移植(Patient-derived tumor xenografts,PDTX,或PDX)模型则具有更多优势,PDX小鼠模型的肿瘤保留了来自肿瘤病人的肿瘤组织分子,遗传,组织学异质性等特征(甚至经过小鼠体内的传代几代之后)。所以,PDX模型也成为目前个性化医学和临床前药物筛选的有用工具。 

 

目前,PDX模型的研究已大规模应用于潜在临床药物预测试验。有研究者通过构建约1000个来自不同类型突变的PDX模型,并应用这些不同的PDX模型对不同药物进行小鼠体内筛选,寻找药物与肿瘤基因型之间的关联性,以达到试验重复性和临床可解释性的统一。

  

不幸的是,PDX模型在研究某些类型肿瘤方面(如雌激素受体阳性的乳腺癌和前列腺癌)的不满意效果成为了限制其应用的主要障碍。而且,PDX模型必须建立在免疫缺陷小鼠上,这样的小鼠缺乏由获得性免疫系统介导的天然抗肿瘤与促肿瘤活动。

   

研究者们也明白,虽然PDX模型缺乏功能性的获得性免疫系统,该模型仍可为临床提供有价值的研究资料。正在进行中的相应改进是通过移植人CD34阳性造血干细胞或前体细胞的方法,重建人免疫系统的人源化的小鼠模型,并取得了显著的成功。虽然来自某些特异谱系的人免疫细胞在小鼠体内的重建仍具有挑战性,但通过引入人相关细胞因子,趋化因子,生长因子等方式,获得促进人骨髓细胞在小鼠体内发育与成熟的效果。

  

为了构建优化能够支持人HLA限制性T细胞发育的免疫缺陷小鼠,应用基因修饰技术建立人源化小鼠模型,将人HLA分子引入至敲除小鼠MHC类型I和II相应区域。人源化小鼠模型能作为免疫疗法临床前评价的有用工具,然而,当人造血干细胞供体来源(如通过脐带血或胎肝)有限时,其现实操作中的较高构建成本也自然成为该模型实际应用的不利因素了。

  

应用不断完善GEM模型研究原发肿瘤

 

 

 

上世纪70年代成功建立小鼠原核注射转基因技术以后,1980年早期借助该方法第一次将克隆癌基因导入小鼠基因组中,成功制备了所谓的致癌小鼠(Oncomice)。 该致癌小鼠是应用乳腺特异性起动子(MMTV)特异性表达癌基因v-HRas的第一个肿瘤GEM模型,该致癌小鼠首次构建成功,证实了该小鼠形成原发乳腺肿瘤,并极大地振奋了肿瘤研究领域团体,因为此研究结果第一次真正证明了癌基因在正常细胞中表达能产生肿瘤的假说。1992年伴随着小鼠胚胎干细胞(ES)基因打靶技术的突破发展,成功构建的肿瘤抑制基因(TSG)敲除小鼠,也证明了该类TSG基因在肿瘤发生过程中的重要作用。

  

虽然致癌小鼠和TSG敲除小鼠提供了非常有价值的理论依据,但这两种模型也存在其局限性。由于转基因技术获得的小鼠是使转入的外源基因表达在特定组织中所有的细胞,TSG敲除小鼠则是灭活体内所有细胞中的相关基因。然而,现实肿瘤的形成过程是在个体中整个组织器官健康的前提下,由于某个单细胞中某种遗传变异的积累而导致的弥散肿瘤现象。为了符合肿瘤形成过程的实际情况,更有必要设计与构建更加合理或复杂的小鼠模型,比如能实现条件性的在体细胞灭活肿瘤抑制基因,或者激活(突变)致癌基因的所谓条件性GEM模型。条件性GEM模型构建的基本原理是将需要修饰基因两端分别加上loxP重组位点,在特定Cre重组酶存在的情况下,loxP两端之间的DNA就可被敲除,达到特定条件下灭活该基因的目的。应用这种模型的第一个成功的例子是应用Cre-loxP系统介导的体细胞灭活Apc基因而构建的小鼠结直肠癌模型。应用腺病毒载体实现Cre重组酶特异性表达于肠上皮细胞,组织特异性敲除APC基因,引起小鼠快速形成散在结直肠腺瘤,其特征与家族性结肠腺瘤性息肉病(FAP)病人有许多相似性。所以,通过发现特异性相关癌症基因的突变体,研究者们可构建在组织学、分子学以及临床上更能模拟肿瘤病人的相似特征的小鼠模型。

  

借助Cre-ERT融合蛋白诱导系统,研究者们可对体细胞中相关靶基因在特定时间与特定组织实施修饰,即将雌激素受体的突变激素结合区域与Cre重组酶融合在一起,建立可诱导调控的Cre重组酶表达系统,当在雌激素类似物(如Tamoxifen)存在的情况下,引起Cre重组酶活性在翻译后激活,发挥其识别loxP位点的作用,实现诱导性切割靶基因的目的。因此,LoxP小鼠(即靶基因DNA两端分别含loxP位点)的条件性基因修饰,通过在选择的时间里加入诱导剂Tamoxifen后,控制Cre-ERT的特异性表达,达到对靶基因进行时空与区域上特定修饰的目的。

  

虽然Cre-loxP系统能用于多于一个基因的修饰,但因这种过程是同时发生的,所以难以完全模拟肿瘤多步骤形成过程中,突变是逐渐积累形成过程的特征。最近,研究者们利用可独立发挥作用的可诱导双重组酶系统(如Flp-FRT/Cre-loxP,或Cre-loxP/Dre-rox),建立了对靶基因表达实施先后调控的修饰方式。该技术方法成功应用的实际意义有如下几方面,1. 独立研究针对肿瘤细胞的自发和非自发通路及过程;2.  模拟人多步骤的癌症形成过程,有续地进行诱导突变;3. 开展独特的肿瘤治疗靶点遗传性评价。

  

肿瘤GEM模型构建策略与技术方面的改进

 

 

  

GEM模型因其独特优势已经被证实是肿瘤学研究的有效工具,但研究者们也一直努力对其进行着不断改进与完善。该类小鼠模型由于在构建与研制过程中周期长,工作量大,以及成本高等原因,特别是对于多个等位遗传位点进行修饰,构建具有遗传特性的新突变小鼠模型,研制过程更耗时,且需要更长久的交配繁殖过程。这也成为限制具有遗传能力的GEM模型广泛实际应用的一个主要因素。近年来,由于肿瘤基因组序列研究技术的广泛普及与应用,以及随着新发现的癌症相关基因突变数量的快速增长,更加需要建立快速新颖的小鼠模型研制策略,实现在体内快速验证潜在致癌基因,以及建立已知病人相关突变的非生殖遗传修饰GEM模型的目的。目前这方面的进展主要有:ES细胞为基础的肿瘤模型;应用CRISPR/Cas9技术基因组编程;肿瘤病人相关位点的改善肿瘤模型。

  

  1. ES细胞为基础的肿瘤模型

为了进一步加快新型人肿瘤GEM模型的研制,将小鼠胚胎干细胞(ESC)经过基因修饰后而作为非遗传修饰(如嵌合体)小鼠直接进行肿瘤学研究已成为一种研究策略。最近报道的GEM-ESC策略,即建立以ES细胞为基础的肿瘤GEM模型。该类模型是在原有基因修饰的基础上,快速构建新型基因遗传修饰小鼠模型。例如,应用GEM-ESC策略,在原有K14cre-Brca1-Trp53(KBIP)的小鼠乳腺肿瘤模型的ESC上,直接导入MET原癌基因,构建新型KBIP-MET的转化乳腺癌模型。研究结果表明,与KBIP小鼠相比,此KBIP-MET小鼠形成的乳腺癌更具有转化特征,表现为更容易形成癌肉瘤。在对肿瘤药物的反应性上,KBIP小鼠模型的乳腺癌对临床RARP抑制剂(如Olaparib)敏感,而KBIP-MET小鼠模型的转化乳腺肿瘤则显示对该抑制剂具有耐受性。

 

  1. 应用CRISPR/Cas9技术的基因组编程

过去十年,伴随新的基因组编程技术(如ZFNs和TALENs)快速发展,2013年出现CRISPR/Cas9基因组编程系统,该类基因组编辑技术成为继PCR技术发展以来,过去几年生物学研究领域的有革命性进步的及影响力最大的技术更新。CRISPR/Cas9系统首先发现于原核生物中针对抵抗外来入侵遗传物质而建立的免疫系统,并很快被成功用于各类物种的基因编辑。借助单一的引导RNA(sgRNAs),Cas9核酸酶成为能特异性作用于基因组任何基因位点,达到基因敲除的目的。通过应用Cas9诱导的DNA断裂和单链核苷酸/供体DNA,该系统也可实现对特定基因突变,或特定插入loxP/FRT重组位点等进行遗传修饰。

  

CRISPR/Cas9技术系统所表现出的同时对基因组不同位点进行有效编辑等基因打靶策略特征,使其立刻成为快速研制肿瘤小鼠模型的最佳选择。目前在人肿瘤病人观察的所有遗传突变都可以通过基因修饰的方法来快速地构建相应的小鼠模型,包括条件性基因敲除,点突变,易位等。另外,也有研究者应用CRISPR/Cas9技术对小鼠的致癌基因和TSGs进行了体细胞(非生殖遗传性)编辑,因为此研究策略的努力与成功,使该系统成为研制肝细胞肿瘤,肺癌,脑癌,胰腺癌,以及乳腺癌的非遗传修饰模型的新方法。

 

最近,CRISPR/Cas9系统也应用于靶基因的抑制(CRISPRi)或激活(CRISPRa)的遗传修饰。这类修饰系统可用于研制相应致癌基因,和/或抑制TSGs基因的诱导和可逆激活小鼠模型。比如借助CRISPRa为基础的系统,通过激活致癌基因的转录,达到研究其致癌潜力的目的。

  

虽然CRISPR/Cas9为基础的基因编辑系统非常具有潜力,但该系统应用于体内基因编辑也存在一定的缺陷,比如,目前该系统策略不适合于验证潜在致癌基因的致癌潜力。另外,将Cas9导入体细胞的基因编辑方式,可引起Cas9特异性免疫反应,导致Cas9表达细胞有被清除的可能性。为了避免这些可能的潜在风险,可选择在免疫缺陷小鼠体内进行相应的实验,或通过基因修饰方法,首先获得对Cas9具有免疫学耐受小鼠模型后,再开展相应的动物实验。最后,虽然已有报道表明,应用引起DNA单链断开的可诱导Cas9n缺口酶,可以降低其脱靶效应, 但研究者在实际应用中必须有清晰认识,要想完全避免由CRISPR/Cas9介导的非设计所需要的脱靶突变是很难的。

 

  1. 肿瘤病人相关位点的改善肿瘤模型

构建理想的肿瘤病人相关突变模型,对研究靶基因在肿瘤发生过程中的作用,以及有效评价药物效应就显得很有必要性与实际意义。因为在人肿瘤抑制基因(TSGs)中,许多具有肿瘤形成依赖的生殖细胞突变和体细胞突变都是错义或无义突变,从而导致突变产物或可能带有功能截短蛋白的形成。这类突变现象是难以通过条件性敲除小鼠模型来实现的,因为条件性基因修饰策略是将靶基因中某个或几个外显子完全敲除,达到灭活靶基因功能。一些研究结果已经表明,参照肿瘤病人相关TSG突变构建的小鼠突变模型,可产生与靶基因完全敲除不同的表型。比如,与Trp53基因敲除小鼠比较,病人相关的Trp53热点突变小鼠表现有更加明显的致癌活性。

   

同样,构建BRCA1乳腺癌病人相关的Brca1基因突变的条件性小鼠模型研究表明,与Brac1完全敲除小鼠模型相比,因Brac1基因中特定RING区域引入突变而引起的乳腺肿瘤,更容易对那些破坏DNA的药物产生耐受性,因为其BRCA1蛋白含有较少的RING活性的缘故。研究也证实,由于突变导致Brac1蛋白含有较少的RING活性 ,表现为更容易对那些破坏DNA的药物产生耐受性,该结果有助于揭示这些突变与治疗反应效果之间的因果关系。

 

GEM模型在肿瘤学研究中的应用范围

  

 

 

作为原发肿瘤发生的GEM模型,可成为体内分析包括肿瘤形成,发展及转移中肿瘤形成等过程中细胞本身与细胞间相互作用的系统选择。人肿瘤GEM模型也已成功应用于验证候选药物靶点,评估治疗效果,以及评价药物耐受机制等方面。由于GEM模型是在具有完整免疫系统的小鼠体内形成原发肿瘤,因此,该类模型更适合潜在肿瘤免疫治疗的探索性研究。建立基因修饰小鼠模型与人疾病紧密相关性研究的策略与方法,为探索与开发肿瘤治疗新方法与策略提供了有意义的应用平台。也为设计和开发新抗肿瘤治疗,提供了临床治疗效果等相关信息。GEM模型在以下几个方面对肿瘤生物学及转化肿瘤学等研究进展及贡献中发挥了重要作用。

 

  1. 验证潜在癌基因

在大量肿瘤样品测序研究获得不断增加的潜在肿瘤基因基础上,建立体内快速验证这些潜在肿瘤相关基因的策略是非常必要和有实际意义的。考虑到速度和相对简单化因素,GEM-ESC和CRISPR/Cas9技术可作为快速验证潜在肿瘤基因的首选方法。特别是应用基于体细胞的CRIPPR/Cas9介导的基因编辑技术,建立非遗传修饰的小鼠模型,实现高通量体内验证潜在肿瘤基因的目的。比如,应用DNA注射与活体电穿孔相结合的转染方法,将引起胰腺管腺癌(PDAC)的13个不同的主要肿瘤抑制相关基因的15个gRNAs/Cas9表达质粒混合物一起导入成熟小鼠的胰腺,构建同时修饰此13个基因的小鼠模型。结果显示,此PDAC小鼠有超过60%的这些靶基因显示基因敲除,提示CRISPR/Cas9介导的突变诱发了肿瘤的形成。同样,利用Dox诱导Cas9表达的GEM模型也被用于验证已知的多种肠道肿瘤基因(如Apc和Trp53)。除了修饰TSGs, CRISPR/Cas9技术还应用于验证染色体重排的致癌性,如在肺癌病人观察到的Eml4-Alk基因的融合现象。

  

另外,应用GEM模型对来自临床病人并筛选获得的候选潜在癌基因进行验证,也已成为研究肿瘤相关基因功能的常用策略。例如,最近胡卓伟教授课题组通过构建条件性过表达和敲除GEM模型,研究假激酶Trib3基因在促进急性早幼粒细胞白血病(APL)形成中的作用,结果表明,同时在小鼠骨髓细胞中特异性表达或敲除Trib3与 致癌蛋白PML-RARa (PR) 融合基因,Trib3基因可显著增加PR诱发APL形成的作用。而吕毅教授课题组则是通过构建Y染色体性别决定区(Sry) 基因特异性表达的GEM模型,首次证实了在肝组织内特异性过表达Sry基因雄/雌小鼠对化学致癌剂(DEN)诱导小鼠肝细胞癌(HCC)形成更加敏感,提示Sry基因在HCC形成过程中发挥了重要的促进作用。

  

  1. 研究致癌基因的依赖性

致癌基因依赖现象是指某些肿瘤形成完全依赖于单一致癌基因。由于条件性GEM模型对基因的修饰是不可逆的,因而不适合研究致癌基因依赖性。因此需要选择不同的调控诱导策略进行相应的研究,例如将致癌基因与ERT融合达到控制其表达的目的。有研究报道,将Trp53-ERT变异体取代内源Trp53建立的纯合敲入小鼠,该Trp53-ERT小鼠只有在Tamoxifen存在条件下,诱导Trp53的表达,并在已形成肿瘤小鼠模型的基础上,研究再恢复p53功能后对已有肿瘤的影响。研究结果表明,在Eu-Myc引起的淋巴瘤基础上,恢复Trp53活性可产生快速细胞凋亡,明显增加小鼠的存活率。另外,多西霉素(Doxycycline,Dox)调控基因表达的可逆诱导系统也被应用于GEM模型的建立,通过该系统诱导人MYC原癌基因的表达后,引起肿瘤的形成。在关闭MYC基因表达后观察,导致原癌基因失活后,已形成的肿瘤的相应反应。该研究是应用Dox的Tet-off诱导系统,持续在小鼠造血干细胞中特异表达人MYC转基因,诱导小鼠形成恶性T细胞淋巴瘤和急性髓系白血病,在此基础上,如果通过添加Dox诱导剂使MYC表达停止后,发现已表现出的肿瘤表型也随之消弱,并证实此过程与肿瘤细胞周期死亡有关。研究也发现,对于此可逆诱导系统中停止激活MYC表达后的长期效果,不同的肿瘤类型是有区别的。如在骨肉瘤中短暂抑制MYC表达,因为肉瘤细胞分化为成熟的骨细胞,所以会出现肉瘤持续萎缩的现象。相反,虽然MYC表达抑制会引起肝癌出现弥漫性的萎缩,但是,存留的肿瘤细胞仍处于潜伏状态,并在重新开启MYC表达后,可以很快恢复其肿瘤特征。

 

  1. 破解自发性转移形成机制

尽管有不断改善的肿瘤治疗选择策略,转移疾病仍然是引起癌症死亡的主要原因。转移过程是通过肿瘤细胞与肿瘤微环境相互持续作用而形成的复杂的多步骤过程。过去绝大多数的临床前转移研究是借助细胞系接种模型来实施的,而这类模型不能真实反映肿瘤病人的转移过程。GEM模型可引起原发肿瘤发展和转移形成,因而是研究过去未知的肿瘤自发转移形成过程不可缺少的工具。由于原发肿瘤的过度生长,在大范围转移形成之前,小鼠一般不得不被处死,这也是GEM模型潜在的不足之处。这一局限可以通过将GEM来源的肿瘤组织进行原位移植的方式解决,比如通过手术移植方式,达到保留供体肿瘤的肿瘤内异质性效果,使其转移过程的发生接近临床上的常见转移疾病。

 

应用GEM模型研究肿瘤转移过程已获得了某些重要的发现。过去的研究认为肿瘤转移是发生在肿瘤形成过程晚期。然而,通过BALB-NeuT和MMTV-PyMT小鼠乳腺肿瘤模型的研究表明,来自早期的损伤转染细胞已经具有传播至骨髓和肺组织而形成微小转移瘤的能力。另外,上皮细胞至间叶细胞间的转移(EMT)被认为在肿瘤细胞传播和转移方面起到了非常重要的作用。然而,应用胰腺癌和乳腺癌GEM模型的研究表明,肿瘤细胞不仅保留了其上皮细胞特征,却还能在转移病灶位置出现,提示EMT在这些模型中的肿瘤转移形成并不是必须的。再有,在探索肿瘤转移形成过程中,肿瘤细胞与免疫系统之间复杂关联方面,GEM模型明显发挥了突出的关键作用。例如,骨髓免疫细胞,如巨噬细胞和中性粒细胞,在促进不同种癌症的转移形成方面,起到了至关重要的作用。最近有研究报道表明,乳腺肿瘤引起系统炎症,即由IL17-产生的T细胞及继发的免疫抑制中性粒细胞的扩增,可引发小叶乳腺癌GEM模型的自发性转移形成,导致GEM移植模型的自发转移疾病。

 

GEM模型在揭示相关基因参与抑制肿瘤转移机制方面也发挥了重要作用。最近,刘宝华课题组应用Tet-ON可诱导Sirt7表达的GEM模型,揭示了Sirt7抑制原发胰腺癌转移作用机制,该研究结果证实,由Dox诱导表达的Sirt7具有明显抑制MMTV-PyMT小鼠乳腺肿瘤肺转移的作用,且其作用机制是通过调节TGF-β信号通路实现的。

  

因此,GEM模型在揭示肿瘤转移复杂性,挑战当下普遍接受的理论(即肿瘤转移是晚期癌症细胞包括EMT在内的转移过程)等方面,都发挥了不可缺少的作用。这些重要的发现有可能为转移癌症病人的治疗提供重要的参考依据。

 

  1. 研究肿瘤微环境作用

在揭示肿瘤细胞外部因子(如癌症相关成纤维细胞(CAFs) 和免疫细胞)如癌症相关成纤维细胞(CAFs) 和免疫细胞与肿瘤形成过程等作用方面,GEM模型已发挥了不可取代的作用。CAFs可通过合成细胞外基质(ECM)成分(如胶原蛋白,纤维连接蛋白,层粘连蛋白)来调控ECM和基底膜形成。而且,CAFs是各种可溶性介导物包括基体金属蛋白酶(MMPs)的来源, 在促使ECM转化,加强其在维持ECM动态平衡方面有着重要作用。GEM模型研究已表明,CAFs在肿瘤形成过程中具有双重作用。利用K4-HPV6鳞状皮肤癌小鼠模型研究发现,在上皮细胞恶性癌转化过程中,CAFs能通过增强炎症,血管形成,以及ECM重新组成,从而刺激肿瘤的发展。

 

相反,通过两个独立的胰腺癌GEM模型的研究表明,在体内抑制CAFs具有加速肿瘤形成过程的效果,提示CAFs对肿瘤的阻止作用。如此相互矛盾的现象对于免疫细胞来说则是可以理解的,起初免疫细胞被认为是可通过攻击转化肿瘤的细胞,抑制肿瘤形成过程。然而,最近的研究表明,这些免疫细胞也具有促进肿瘤的功能。应用小鼠模型对一些不同的肿瘤类型的研究已揭示了炎症与肿瘤之间的相互关系。例如,应用大肠炎相关癌症的小鼠模型,在髓系免疫细胞中特异性敲除NF-jB信号系统后,减缓小鼠肿瘤生长,表明其具有促进肿瘤的作用。

  

另外,K4-HPV6小鼠模型研究也表明,肥大细胞与骨髓来源细胞借助MMP9激活血管生成和重新调整基质结构等方式,发挥其促进鳞状皮肤癌形成作用。应用同样的皮肤癌症模型发现,慢性炎症有促进新生肿瘤形成的作用。至此,人们已经开始对炎症诱导肿瘤的相关巨噬细胞和中性粒细胞的促进作用进行研究。例如,在MMTV-PyMT乳腺癌小鼠模型基础上,将一种重要的巨噬细胞相关基因CSF1 (Colony-stimulating factor1 )敲除后发现,该小鼠的乳腺肿瘤恶性化过程被延缓。同样,抑制CXCR2(一种介导中性粒细胞迁移的趋化因子)则有抑制APC小鼠的肠道肿瘤形成的效果。总之,这些研究强调了免疫细胞在肿瘤发生与发展过程中,发挥了协同参与调控的作用。

 

  1. 确定肿瘤细胞的来源

揭示肿瘤发生过程中的细胞来源将为开发与改善治疗策略提供非常重要的理论基础。应用GEM模型已经成功阐明了某些不同肿瘤类型的细胞起源。在小细胞肺癌(SCLC)研究中,通过气管内注射细胞特异性的Adeno-Cre病毒载体,使Trp53和Rb1两基因分别在Clara细胞, 神经内分泌的(NE)细胞,以及II型肺泡(SPC)细胞被特异性敲除,分析肿瘤发生的不同时间和肿瘤表型等。结果表明,相对于SPC细胞,NE细胞是造成SCLC形成的主要细胞来源。另外,细胞来源的研究也能提供与以前研究结果不一样的意外结果。比如,过去以BRCA1为基础的乳腺癌研究认为,该类癌症的来源细胞是基底上皮干细胞。而在应用GEM模型对BRCA1引起的基底样乳腺癌研究中发现,其实管腔祖细胞才是基底样肿瘤的真正来源。

 

最近来自两个不同实验的研究结果表明,遗传变异(如Pik3ca突变)可显著地影响干细胞库组成。Pik3ca点突变(如H047R)引起具有谱系特征的乳腺上皮细胞分化为多能干细胞样状态能力损失。而且,Pik3ca乳腺肿瘤的细胞来源主导了其恶性程度,表明了在改善抗癌症药物及治疗效果的特异性方面,准确找到肿瘤细胞来源具有非常重要的实际意义。

 

  1. 验证新药物靶点

考虑到不是所有的癌基因都是维持肿瘤形成所必须的,因此,在针对相应的靶点药物,开展人体临床试验前,即在临床前的动物体内,验证灭活TSG,或者降低致癌基因是否能引起进行中肿瘤的萎缩成为非常重要的试验。应用可诱导小鼠模型可实现对致癌基因维持肿瘤相关性的验证,如在乳腺癌小鼠模型中,癌基因Pik3ca表达去诱导后,引起部分肿瘤的萎缩,提示这些肿瘤是与“依赖”广泛性活性P13K信号密切相关的。然而,多数肿瘤最终因Met或Myc增加而复发,提示这些遗传损伤可能会诱导对P13K抑制剂的耐受性。此例子说明可诱导GEM模型应用于临床前研究,不仅可达到验证药物靶点的目的,而且对揭示药物耐受性的形成机制也具有其实际意义。

  

TSG也有可能成为有效的药物靶点。由于p53基因的显性负作用或抑制突变,以及其特异性抑制剂MDM2和MDM4的增加/过表达等的原因,导致肿瘤中的p53功能丧失。应用可逆转抑制p53活性的GEM模型遗传学研究表明,重新恢复p53基因功能,可快速使已形成的肿瘤消退,提示研制抑制MDM2分子,从而恢复p53功能,或将突变型p53重新恢复为具有野生型功能p53的抗肿瘤药物的临床意义。同样,应用可诱导敲低APC的GEM模型研究结直肠癌的结果也表明,诱导恢复APC功能后,可迅速引起快速与广泛的肿瘤细胞分化和持续的无复发萎缩,这为体内评价APC/Wnt通路作为APC突变引起的结直肠癌的治疗靶点提供了依据。

 

  1. 阐明治疗效应与耐受

为了将临床试验中抗肿瘤新疗法失败的风险尽量降低到最低,建立临床前高效及预测性强的体内模型,客观评估相应药物效应及耐受性就显得更加重要。通过Kras突变引起的肺癌和胰腺癌的GEM模型的研究发现,GEM模型对靶向治疗和传统化疗的应答效应与相应病人的应答性具有非常大的相似性。需要加以关注的是小鼠与人在药物代谢方面表现明显不同,比如,参与肝脏药物代谢的细胞色素P450酶底物特异性方面,不同的物种存在较大的差异。该类问题可借助人源化小鼠模型加以解决。因此,建立人源化的GEM模型作为临床前药物效果的研究,将有助于优化针对靶特异抗肿瘤药物的研发,以及寻找与确定治疗效应的关键因素,并使其成为肿瘤病人特征的预测性生物标记。另外,GEM模型也可应用于探索治疗敏感性肿瘤获得性耐药的形成机制。

 

在探讨肿瘤治疗效应与耐受机制方面,K14cre; Brca1-f/f; Trp53-f/f (KB1P) 小鼠是作为BRCA1突变乳腺癌临床前GEM模型的一个非常有说服力的例子。KB1P小鼠可形成完全模拟类人BRCA1突变乳腺癌组织病理学特征的乳腺肿瘤,而且,对含铂类药物和PARP抑制剂也具有高敏感性。临床试验证实,PARP抑制剂Olaparib可以治疗卵巢肿癌,乳腺癌和结直肠癌。 虽然该药物并不对所有这类癌症病人的治疗都有效果,但其对BRCA1突变携带者表现有明显治疗效果,可能与PARP抑制剂合用引起的协同致死作用与BRCA1缺乏有关。BRCA1突变细胞对PARP抑制剂表现为更加容易被损伤,因为PARP抑制剂诱发的单一链DNA断裂,可导致DNA复制时的双链断裂,造成BRCA1缺失细胞无法实施同源重组机制来修复损伤的DNA。

 

根据Olaparib在临床试验中获得的理想效果,FDA于2014年12月批准了该药用于BRCA1/2突变卵巢癌病人的治疗。尽管病人对该药物有很好的反应效果,然而,在病人和GEM模型研究中都发现了获得性药物耐受性。通过临床前KB1P小鼠模型研究证实,这类耐药机制与药物运输物及同源重组恢复等数量的增加有关。这些研究结果有助于了解临床上耐药性的产生, 以及设计针对Olaparib耐药病人的改进治疗策略。

 

关于肿瘤治疗效应与药物耐受性的关系,现在也是越来越清楚,即其影响不仅受肿瘤细胞自身因素,而且与成纤维细胞和免疫细胞等基质因素有关。通过PDAC的GEM模型进行肿瘤干预研究的结果表明,治疗是抑制旁泌性相关信号通路,减少促结缔组织增生肿瘤基质,增加肿瘤脉管系统,导致促进抗肿瘤药物导入肿瘤部位的过程。然而,关于攻击PDAC中的肿瘤基质的概念,最近有两个研究对该理论进行了挑战。这两研究结果表明,基质因素可能通过阻止肿瘤血管形成,引起不是促进而是抑制PDAC生长。所以,这些研究都揭示了肿瘤微环境在治疗耐受性方面,发挥了比过去想象的更加重要的,且复杂的作用。

 

  1. 肿瘤免疫治疗

在过去十年,通过对免疫反应的深刻揭示与认识,建立了利用病人免疫系统攻击肿瘤的治疗策略。近年来的黑色素瘤和肺癌临床病人试验已证实,包括抗CTLA-4和抗PD-1的免疫检查点抑制物,在增强病人有效抗肿瘤免疫及改善生存率等方面具有巨大潜力。这些临床试验基础是来自过去几十年在实验小鼠模型上开展的基础研究,从而揭示了CTLA-4和PD-1在阻止免疫反应中的重要性,特别是通过对CTLA-4和PD-1敲除小鼠出现严重与温和程度的自发性自身免疫表型的明确证实,应用CTLA-4抑制物引起接种肿瘤小鼠的抗肿瘤T细胞反应增加,产生肿瘤排斥作用,提示释放T细胞上的刹车可能是抵抗肿瘤的一个潜力的应对策略。尽管如此,同时也应该清楚的了解,仍有一定比例的病人对此类免疫治疗没有反应,且目前的挑战是还不知道其真正原因。

  

目前,虽然绝大部分的免疫学研究都是在肿瘤移植小鼠模型的基础上进行的,但就现在研究情况预测表明,今后GEM模型应用于该领域的研究将会越来越多。应用GEM模型研究的部分结果表明,在新形成的肿瘤过程中,因肿瘤引起的耐受机制,T细胞丧失其对肿瘤细胞的反应性,特别明显的是,如果将来自GEM模型小鼠形成的肿瘤细胞,接种至免疫缺陷小鼠体内,肿瘤会快速生长,而野生小鼠则能排斥这些肿瘤细胞。提示这些肿瘤细胞没有失去其免疫原性,T细胞仍然能识别这些细胞并发挥其攻击作用。但在原发肿瘤小鼠的体内这些T细胞却无能为力。

  

肿瘤常常被认为是慢性炎症的结果,这种炎症可引起局部和系统免疫抑制,从而不利于T细胞发挥其有效的功能。而且,肿瘤常表现为树状突细胞(DC)功能缺失,导致T细胞启动缺损。例如,在MMTV-PyMT乳腺肿瘤小鼠模型中发现,原本具有潜在激活抗肿瘤T细胞的DC细胞,会被大量存在的巨噬细胞竞争抑制,这些巨噬细胞起到了阻止特定T细胞激活的作用。最近的研究也证实,促进DC细胞功能或阻止骨髓细胞引起的免疫抑制,可以达到改善免疫检查点抑制物的抗肿瘤效果。因此,对肿瘤病人实施耐受T细胞免疫激活疗法的时候,结合应用针对改善免疫抑制或则增强T细胞启动的靶点药物,在临床上可能会起到更好的治疗效果。

  

相对于肿瘤接种模型,应用GEM模型进行免疫治疗研究需要不同的方法。考虑到GEM模型中肿瘤是在每个独立小鼠体内发生的,如同病人肿瘤的发生过程,具有特殊的肿瘤抗原。因而,具有其异质性的特点,从而确保区别鉴定反应和非反应肿瘤之间的分子不同,也有助于临床预测的生物标记物的建立。然而,对于大多数GEM模型来源的肿瘤来说,辨认可被T细胞识别的表达肿瘤抗原却是未知的。为了克服这点,可借助基因修饰的方式,将临床上相关肿瘤抗原引入小鼠体内,使其具有诱发肿瘤特异性T细胞反应的效果。比如,应用低免疫原性的肿瘤(如肉瘤和肺癌),将肿瘤特异性抗原引入至GEM模型后,这些肿瘤的免疫原性增加,引起潜在而短时间的抗肿瘤T细胞反应。起初的抗肿瘤T细胞反应很快发生,然后是可调控T细胞介导的免疫抑制。因此,这些模型将有助于目前与未来相关研究,以达到揭示免疫逃逸的复杂机制,最终研发具有改善的肿瘤免疫治疗的新策略的目的。

 

  1. 与临床试验并行的GEM模型

最近推出的“与临床共试验” 范例,目的是将临床前GEM实验与人体临床试验同时开展,从而达到预测治疗效果的作用。该策略已经应用于前列腺癌治疗中,并成功揭示了由雄性激素诱发的耐受性与某些遗传关键因子有关,以及克服去势难治性的新综合疗法。同样,应用NSCLC的GEM模型的一起临床试验表明,Kras/Lkb1突变肺癌较Kras or Kras/p53突变肿瘤对临床上的Docetaxel和MEK抑制剂Selumetinib的联合疗法,表现为更加具有耐受性。揭示了LKB1是临床试验中对此类药物联合疗法耐受的潜在决定因素。这类研究表明,应用GEM模型作为人肿瘤临床前药物效果研究,能发现新的生物标记物和联合疗法。

 

GEM在肿瘤学研究中发展趋势与未来展望

   

 

 

许多抗肿瘤药物在临床试验中未能达到临床前实验的期望目的,已经成为目前肿瘤学与转化癌症医学所面临的巨大挑战,如何改善肿瘤学领域的临床前研究结果的预测性,也是人们十分关注的热点。因此,如何选择更能真实反映人肿瘤疾病发生发展过程的临床前肿瘤动物模型,将显得更加重要了。为了实现这一目的,首先需要考虑的是如何建立能真实反映肿瘤本身及外在特征的临床前小鼠模型。比如,临床前模型应该含有病人特异性突变,该种突变具有诱发恶性肿瘤的趋势,且在一定病人群中显示遗传变化特征。另外,原发的肿瘤过程是在自然微环境中进行的,如同在人肿瘤进行过程中所见的肿瘤细胞与肿瘤微环境之间相互作用(包括免疫细胞,成纤维细胞,以及淋巴细胞和血管的潜入)。再有,由于绝大多数进入临床试验的病人已经是处于广泛肿瘤转移疾病过程中,因此,实验设计时就应该考虑选择能模拟病人疾病不同进程状态的小鼠模型,开展相应的临床前的药物效果评估研究。在现实的临床试验中,往往进入临床试验的病人之前多是经过不同程度的治疗,因而极有可能会干扰治疗效果的验证。而临床前的动物研究则是建立在从来没有接受任何治疗的基础上进行的,从而导致高估治疗效果的结果。从另外一方面讲,临床试验中对那些接受过治疗的严重病人没有效果,却仍有可能对没有接受过治疗的严重病人有益处。

  

最近基因修饰模式动物技术的进展,促进了快速研制更加精准的能引起原发肿瘤的小鼠模型,该类模型结合了特异性肿瘤病人形成发生发展过程中肿瘤细胞本身和细胞外的特征。预测这些新一代的GEM模型和基于GEM模型的移植模型,将是真实模拟病人肿瘤发生发展过程,研究自发性转移疾病的最佳模式动物。这些模型可作为研究肿瘤形成的复杂过程(包括肿瘤的起始,器官特异性转移的形成,肿瘤微环境的参与等方面)的重要而有用工具。但是,对于肿瘤病人而言,更加重要的是,这些模型能更为深入地揭示免疫治疗中的反应性与耐受性,以及疾病的复发等相关机制。期待未来,应用新一代GEM模型对抗肿瘤新药物临床前的评估研究,将会增加预测其在临床试验中的成功率,从而加速抗肿瘤新药策略设计与临床实施,达到改善防治肿瘤病人的病情的最终目的。

 

作者简介

 

 

俞晓峰博士,国际知名模式动物和细胞生物学专家,先后就任于耶鲁大学医学院、iTL基因打靶公司和纽约大学医学院以及美国ASC生物技术公司等机构,在遗传修饰模式动物领域有超过20年的研发和管理经验。目前任职于赛业生物科技,任高级副总裁和高级科学家,主要负责基因修饰模式动物平台的技术工作,其研究成果多次发表在Nat Immunol、Mol Cell Biol等高水平杂志上。

 

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