基于CRISPR的两种核酸检测新工具[新品推荐]

日期: 2018年09月12日


    

前言:测核酸的时候,大家都希望特异性和 灵敏度越高越好。然而,目前的检测方法要么缺乏灵敏度,要么缺乏特异性,要 么太贵太复杂,总之,缺点一大堆。好在,科学家近日利用Cas9蛋白的变体 Cas13和Cas12a开发出简单又便宜的平台,能够可靠检测低水平的核酸。

 

Cas9蛋白

图片来源于网络 仅供参考

 

CRISPR技术的两大豪门实验室分别开发 出了一种工具。张锋实验室利用Cas13蛋白的天然RNase活性开发和优化了一种方 法,包括SHERLOCK和SHERLOCK v2。Jennifer Doudna的实验室则利用Cas2a的非 特异性ssDNA降解开发出另一种称为DETECTR的方法。

 

SHERLOCK和DETECTR分别利用Cas13和Cas12a 对邻近ssRNA和ssDNA的切割和降解,来切割和激活报告基团。随后对这个报告基 团产生的信号进行测定,即可确定感兴趣的DNA、RNA或突变是否存在。这两个系 统都证实了CRISPR在诊断上的潜力。

 

SHERLOCK

 

Cas13(C2c2)是在2016年由张锋实验室发 现的。在单个CRISPR RNA(crRNA)的引导下,它能够切割ssRNA或mRNA(类似于 RNA干扰),实现基因敲低方面的应用。同时,Cas13还附带非特异性的ssRNA切 割功能。SHERLOCK方法利用Cas13的混合RNase活性以及可淬灭的ssRNA报告基团 ,通过等温扩增步骤来快速检测单个DNA或RNA分子。

 

工作原理

 

在crRNA的引导下,Cas13识别并结合目标序 列,这激发了它对周围ssRNA分子的“胡乱”切割。激活的Cas13切割 可淬灭的荧光RNA,产生可定量的信号,表示目标核酸的存在。为了提高分析的 灵敏度,样品的DNA或RNA首先经过RPA或RT-PRA扩增。RPA与T7转录相结合,将扩 增后的DNA转化为RNA,便于后续的Cas13检测。这些步骤使得SHERLOCK的灵敏度 达到attomolar,特异性达到单碱基错配。

 

张锋实验室曾经证实SHERLOCK系统能够可靠 检测亲缘关系相近的寨卡病毒和登革热病毒。它可检测血清、尿液和唾液中低浓 度的寨卡病毒,并确定病毒载量,区分不同病毒株。它还可以对人类DNA进行基 因分型,并鉴定游离DNA中的低频率癌症突变。

 

SHERLOCK v2

 

当然,SHERLOCK也存在一些限制。第一个限 制是定量,因为系统依赖DNA的预扩增,这会导致报告基团饱和。SHERLOCK v2则 在预扩增步骤中使用较少的引物,可以实现更好的定量而不影响灵敏度。研究人 员还综合考虑多种Cas酶的切割偏好来创建一个多重平台。比如,在同一个反应 中使用Cas13和Cas12a以及不同的荧光报告基团,可以准确检测多个目标。

 

SHERLOCK的第二个限制是它对荧光的依赖, 这需要额外的设备来获取数据。于是,研究人员又对SHERLOCK v2进行了改进, 让切割后的报告基团可通过试纸条来检测,就像验孕棒一样。这样,通过试纸条 上的条带数量,就能确定目标DNA或RNA是否存在于特定样品中。试纸条方便运输 ,操作简单,不到一小时就能出结果,因此核酸检测可随时随地开展。

 

SHERLOCK v2这种核酸检测方法具有高灵敏 度和高特异性,且不影响速度、易用性和便携性。因此,未来具有广阔的应用前 景,包括临床诊断(比如病原体或病毒检测)、治疗和基因分型。SHERLOCK v2 的优点在于实验室和现场都能轻松高效地开展。

 

DETECTR

 

Cas12a(Cpf1)是CRISPR Cas的一种变体, 与Cas9一样能够切割dsDNA。不过,Cas12a识别不同的PAM位点,催化其自身的向 导RNA成熟,并在dsDNA断裂后产生5’和3’交错的末端,特别适合基 因编辑。

 

Jennifer Doudna的实验室在研究中发现, 通过crRNA靶向感兴趣的dsDNA目标后,Cas12a还能以非特异性的方式切割ssDNA 。这种非特异性的反式切割表现出多次周转事件(每秒约1250次)。于是, Doudna实验室便利用Cas12a的DNase活性开发出高度灵敏的DNA检测平台DETECTR 。【CRISPR-AI cKO小鼠精子库现货库存,超 600品系,仅需4.68万!】---现货条件性基因敲除小鼠!点击了解详情

 

工作原理

 

DETECR的工作原理与SHERLOCK相似。Cas12a 通过crRNA靶向特定的DNA序列,如人乳头瘤病毒(HPV)基因组。同时将ssDNA- 荧光淬灭(FQ)报道基团加入反应中,它在ssDNA降解时产生信号。为了提高灵 敏度,首先通过RPA的等温扩增来扩增DNA。当Cas12a-cRNA与目标dsDNA配对时, Cas12a的DNase活性启动。随后,周围的ssDNA被降解,包括ssDNA-FQ报道基团在 内。荧光信号可指示您感兴趣的DNA是否存在。

 

作为概念证明,研究人员利用DETECTR方法 来检测HPV。他们发现,DETECTR可以在一小时内准确地区分人类细胞中两种相似 的HPV亚型,HPV 16和HPV 18,灵敏度达到attomolar。因此,DETECTR具有快速 检测患者样品中特定目标的能力,且具有高选择性和灵敏度。

 

DETECTR能够高效检测混合样本中的核酸, 适用于一系列分子和临床诊断应用。Mammoth Biosciences公司已经着手对 DETECTR技术进行开发,它的目标是提供基于CRISPR的平台 ,并以此基础开发各 种生物传感的检测。(赛业生物 https://www.cyagen.com)

 

原标题:基于CRISPR的两种核酸检测新工具[新品推荐]

 

本文来自“生物通”,转载的目的在于分享见解。如有侵权,请 告知删除!

 

【赛业生物科技简介】

作为实力雄厚的基因工程鼠技术平台,赛业 生物已服务全球数万名科学家,赛业产品与技术已直接应用于包括CNS(Cell, Nature, Science)三大期刊在内的2030篇学术论文。2016年,TurboKnockout把 ES打靶金标准推向新高度;同年,CRISPR-Pro使大片段敲入及条件性基因敲除变得更加高效;2017年, AlphaKnockout基因打靶专家系统首次实现基于人工智能的最优化方案设计;同 年7月,推出万例CRISPR-AI敲除小鼠资源库。赛业一步一个脚印,踏实前行,助 力中国科研!

赛业生物微信二维码
  • 招聘
  • 侧边栏广告 - 科研奖励基金计划