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中国学者同期两篇Science文章:CRISPR单碱基编辑的脱靶问题和解决方案

日期: 2019年03月04日


    

基因编辑工具的快速发展令生物学研究领域着迷,目前第三代DNA剪刀的主角是CRISPR,而2016年新出现的一种​​新碱基编辑方法:不会引起随机的DNA缺失和插入,而是替换一个DNA基因,也吸引了生物学家的注意。

 

这种称为单碱基编辑的方法是由与CRISPR-Cas9(nCas9,切口酶)变体与另外一种称为胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)构成,用T代替C,通过导向RNA直接指向正确DNA位置。

 

单碱基编辑器主要分为两类,胞嘧啶单碱基编辑器(CBE)与腺嘌呤单碱基编辑器(ABE),分别由胞嘧啶脱氨酶或改造的腺嘌呤脱氨酶与nCas9蛋白融合而来,对应地可在基因组中的靶向位点实现C>T或A>G的碱基编辑。目前,CBE与ABE已在多个物种中得到了广泛应用。

 

然而,对它们脱靶效应的检测还很不充分,数据主要来源于体外实验研究或者对利用生物信息学软件预测的有限的靶序列相似位点的检测,CBE与ABE在体内全基因组范围的脱靶效应还未得到评估。

 

来自中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组首次在体内利用全基因组测序技术全面分析和比较了三种单碱基编辑系统在基因组水平上的脱靶效应。

 

他们在植物中对BE3(基于融合rAPOBEC1胞嘧啶脱氨酶的CBE系统),HF1-BE3(高保真版本BE3)与ABE单碱基编辑系统的特异性进行了全基因组水平评估,首次在体内利用全基因组测序技术全面分析和比较了这三种单碱基编辑系统在基因组水平上的脱靶效应。

 

这项研究对经过不同单碱基编辑系统转化的56棵T0代水稻植株与21株对照植株进行全基因组测序。进一步序列统计分析发现,经过单碱基编辑系统处理后,基因组内的插入或删除(indels)突变的数量与对照组相比没有显著变化,但是BE3与HF1-BE3,无论是在有无sgRNA的情况下,均可在水稻基因组中造成大量的单核苷酸变异(SNVs),且大部分为C>T类型的碱基突变。与经过农杆菌转化但不含任何碱基编辑系统的对照植株相比,BE3系统和HF1-BE3系统处理的植株在基因组范围内的C>T SNVs分别增加了94.5%和231.9%,大约额外产生了98个C>T SNVs和242个C>T SNVs。

 

这项研究表明现有BE3和HF1-BE3系统,而非ABE系统,可在植物体内造成难以预测的脱靶突变,因此,需要进一步优化提高其特异性。该工作创新性地利用相似遗传背景的克隆植物及全基因组重测序解决了以前大量异质细胞序列分析的复杂性。

 

此外,中国科学院神经科学研究所、上海脑科学与类脑研究中心与计算生物学研究所等处合作,建立了一种被命名为GOTI(Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection)的新型脱靶检测技术,为基因编辑工具的安全性评估带来了突破性的新工具,有望成为新的行业检测标准。

 

这项研究与上述研究均发表在3月1日的Science杂志上,本文通讯作者为中科院神经所杨辉研究员, 计算生物学所李亦学研究员,斯坦福大学Lars M. Steinmetz教授。

 

要提升检测脱靶效应的精度,就必须彻底颠覆原有的脱靶检测手段。首先,为了实现不借助于脱靶位点预测,这就要求必须找到非常严格的对照组来确定基因突变的位点;同时为了检测不依赖于sgRNA的随机突变,最好使用基于单细胞全基因组测序。

 

为了实现以上目标,杨辉研究组与合作者建立了一种名叫“GOTI”的脱靶检测技术。研究者们在小鼠受精卵分裂到二细胞期的时候,编辑一个卵裂球,并使用红色荧光蛋白将其标记。小鼠胚胎发育到14.5天时,将整个小鼠胚胎消化成为单细胞,利用流式细胞分选技术基于红色荧光蛋白,分选出基因编辑细胞和没有基因编辑细胞,再进行全基因组测序比较两组差异。这样就避免了单细胞体外扩增带来的噪音问题。而且由于实验组和对照组来自同一枚受精卵,理论上基因背景完全一致,因此直接比对两组细胞的基因组,其中的差异基本就可以认为是基因编辑工具造成的。

 

在杨辉实验室全体成员与合作单位的共同努力下,GOTI系统被成功建立了起来。借助于这个系统,团队成员先是检测了最经典的CRISPR/Cas9系统。

 

结果发现,设计良好的CRISPR/Cas9并没有明显的脱靶效应,这个结果结束了之前对于CRISPR/Cas9脱靶率的争议。然而团队还检测了另一个同样被给予厚望的CRISPR/Cas9衍生技术BE3,这个系统可以精确引入点突变,在之前的研究中从未发现过有明显的脱靶问题。

 

然而在GOTI的检测下发现,BE3存在非常严重的脱靶,而且这些脱靶大多出现在传统脱靶预测认为不太可能出现脱靶的位点,因此之前方法一直没有发现其脱靶问题。团队分析后认为,这些脱靶位点有部分出现在抑癌基因上,因此经典版本的BE3有着很大的隐患,目前不适合作为临床技术。研究团队的这些重要发现,证实了以BE3为代表的部分基因编辑技术存在无法预测的脱靶风险,让世人重新审视了这些新兴技术的风险。

 

更重要的是,此工作建立了一种在精度、广度和准确性上远超越之前的基因编辑脱靶检测技术,有望由此开发精度更高、安全性更大的新一代基因编辑工具,建立行业的新标准。

 

原文标题:

Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos

Cytosine, But not Adenine, Base Editors Induce Genome-wide Off-target Mutations in Rice

 

转载标题:中国学者同期两篇Science文章:CRISPR单碱基编辑的脱靶问题和解决方案

 

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【赛业生物科技简介】

 

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