CRISPR迈入临床前奏：科学家找到了提高CRISPR效率的方法

红色标记的肌营养不良蛋白：治疗前（左）；治疗后

德州西南大学的研究人员使用单切割基因编辑技术编辑小鼠和人类细胞，以纠正DMD常见突变。

在测试这项技术的同时，科学家们发现，调整CRISPR基因编辑成分的剂量可以显著改善被编辑基因产生肌营养不良蛋白（dystrophin）的数量。进一步发现了根据被编辑DNA调整的最优组分比例。

“当我们在肌营养不良蛋白基因的缺陷部位测试CRISPR时，配方对结果优化可能非常重要，”文章作者Eric Olson博士说。“这一新见解将指导CRISPR作为DMD等疾病的治疗策略。”

意外发现

研究人员使用的基因编辑技术需要两种成分：切割DNA的Cas9酶和引导Cas9酶进入待编辑基因组特定DNA序列的引导RNA。

Olson实验室的方法是通过将Cas9加载到腺相关病毒（AAV）中来编辑肌营养不良蛋白基因的缺陷部分。AAV是一种无害的病毒，同理，引导RNA也被加载入AAV。

该方法修正了突变，使肌肉纤维产生了肌营养不良蛋白，Olson实验室的大型哺乳动物、小鼠和人类细胞实验也都呈现阳性结果。

研究小组使用1:1比例的Cas9和引导RNA，使肌肉中肌营养不良蛋白的生产恢复到了正常水平的90%以上。

但是针对基因的不同靶位，研究人员发现，相同的1:1比例并没有起到同样的作用，在血液输送的情况下，肌营养蛋白的产生只恢复到正常水平的5%。

通过反复试验，科学家发现引导RNA与Cas9的比例在10:1时，可以对肌营养蛋白基因的特定片段实现最佳编辑。一个剂量的CRISPR在四周内恢复了患有常见DMD突变小鼠肌肉和心脏纤维约90%的肌营养蛋白生产力。

“我们一直分别使用等量的病毒来递送引导RNA和Cas9，但我们没有考虑改变比例，”文章一作Yi-Li Min博士说。

缺陷外显子

DMD是男孩最常见的致命性遗传病，早在30岁早期就会因肌肉和心脏衰竭而过早死亡。几十年来，科学家已经知道组成肌营养不良蛋白基因的79个外显子任何一个出现缺陷都会导致这种疾病，然而直到现在还没有有效的治疗方法。

Olson博士发表了多项在DNA突变部位进行一次切割的相关研究，最近他们的重点是删除外显子44，该靶点是五大常见缺陷之一，修正外显子44的临床治疗可能造福大约12%患者。

尽管他们的技术尚未被批准用于临床，但Olson博士的研究小组去年在《Science》杂志发表的研究表明，该CRISPR编辑对外显子51的编辑成功阻止了狗DMD的发展，大型哺乳动物的成功意味着朝向人类目标的递进。

实验室正在对狗进行长期研究，以测量肌营养不良蛋白水平是否保持稳定，并确保基因编辑不会产生不良副作用。Olson希望下一步是超越狗的临床试验，包括德州西南大学的基因治疗计划将在未来几年启动，以解决许多致命的儿童疾病。

“在进入临床之前，还有更多工作等着我们去做，回头看看我们已经走了多远，真是令人兴奋，”Olson说。

原文检索：CRISPR-Cas9 corrects Duchenne muscular dystrophy exon 44 deletion mutations in mice and human cells.Science Advances 06 Mar 2019

Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science 05 Oct 2018

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