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《BioTechniques》上提出了优化CRISPR/Cas9实验的指南和工具

日期: 2019年06月24日


    

在一系列的基因组编辑工具中,CRISPR/Cas9系统因简单易用而广受人们欢迎。尽管这是一种强大的工具,但基因组编辑实验的实际效果会受到各种参数和生物学因素的影响。为此,比利时布鲁塞尔自由大学的研究人员在最新一期的《BioTechniques》上提出了优化CRISPR/Cas9实验的指南和工具。

 

目标位点的选择

 

研究人员认为,认真确定目标位置是至关重要的。对于许多应用而言,功能丧失(loss-of-function)分析必不可少。常规的策略是利用sgRNA将Cas9核酸酶引导到蛋白质编码基因的N端外显子。在Cas9核酸酶的作用下,通过容易出错的非同源末端连接(NHEJ)来修复双链断裂,从而引入移码突变和提前终止密码子。

 

CRISPR诱导突变的高效率让基因敲除变得很轻松。然而,在靶向细胞必需的基因时,这却成了一个问题。之前,两项不同的全基因组CRISPR筛选已经确定人类基因组中大约有2000个必需基因。最近,Lenoir等人发布了一个数据库,可以从中搜索到不同人体组织中的必需基因。

 

因此,在研究功能丧失时,RNAi或CRISPRi已成为有效的替代研究方法,它们的效果可通过转录组水平的分析来直接评估。同时,诱导型的CRISPR工具实现了时间严格控制的基因组编辑。

 

作者还建议仔细评估目标区域的遗传多态性,因为它可能对CRISPR/Cas9的效果产生相当大的影响。尽管sgRNA与目标序列之间允许存在五个以内的碱基错配,但PAM及其附近序列对序列一致型有着更严格的要求。在选择sgRNA时,应当验证PAM和sgRNA结合位点是否存在SNP,因为这会影响Cas9的结合和切割。

 

值得注意的是,实验室中常用细胞系的DNA序列可能不完全对应于基因组数据库中的序列。在设计sgRNA之前,对目标位点进行测序可解决这一潜在的问题。细胞系倍性也是需要考虑的因素。许多癌细胞系携带四条或更多的染色体拷贝。完全敲除需要在目标基因的所有拷贝上引入突变。在产生突变克隆细胞系时,强烈建议对目标基因座进行测序,以确认纯合性敲除。

 

此外,染色质的状态也大大影响Cas9结合和核酸酶活性。核小体的定位直接阻碍Cas9在体内和体外的结合和切割。染色质高级结构也会影响Cas9结合和酶活。一些研究表明Cas9切割效率与开放染色质呈正相关。虽然一些基因编辑应用程序可以选择易于切割的目标,但这种做法显然不适用于基因修复及其他的治疗应用。

 

模式生物的基因靶向为人们带来了更多的挑战,因为染色质景观在不断变化,以确保早期发育过程中的生长和分化。作者认为,转录组图谱(RNA-Seq)和染色质开放性图谱(ATAC-Seq和ChIP-Seq)是很有用的资源,可以预测sgRNA的效率。全基因组小鼠(Brie)和人类( Brunello)文库的发表极大地促进了小鼠和人类细胞的基因编辑。

 

导入方法

 

将CRISPR/Cas9组分导入细胞通常是利用DNA导入系统来实现的,比如将编码Cas9和sgRNA的质粒转染到细胞内。病毒颗粒的转导也是一种常用方法,往往比质粒转染更有效,适用于包括原代细胞在内的许多种细胞。

 

质粒转染和病毒转导分别实现了Cas9的瞬时表达和永久表达。当然,Cas9的长时间表达会导致脱靶事件的积累。因此,人们试图控制Cas9和sgRNA的表达时间,以便降低脱靶效应。研究发现,强力霉素(doxycycline)诱导的启动子可实现Cas9的瞬时表达,并且与慢病毒载体兼容。

 

若担心质粒整合的问题,可以使用Cas9/sgRNA核糖核蛋白(RNP)复合物来实现基因编辑。Cas9 RNP复合物可自行制备,或从各个供应商处购买。RNP复合物的导入方法也有很多种,比如脂质体转染、电穿孔、显微注射等。对于植物细胞而言,用基因枪导入Cas9 RNP复合物或编码Cas9和sgRNA的质粒似乎是一种不错的方法。

 

研究发现,RNP复合物在导入12至24小时内切割染色体DNA,而基因编辑的频率在1天后到达平台期。若采用质粒来表达Cas9和sgRNA,在导入3天后才能达到相同的基因编辑水平。此外,Cas9蛋白在24至48小时内迅速降解,而质粒可连续表达几天。因此,RNP复合物的使用可减少脱靶效应。

 

RNP复合物的另一个优点是适用于各种模式生物和细胞类型。研究发现,对体内环境而言,Cas9/sgRNA RNP复合物的功能优于其他导入方法。以斑马鱼研究为例,人们将编码Cas9的mRNA或Cas9蛋白连同sgRNA一起显微注射到受精胚胎中进行诱变。与编码Cas9的mRNA相比,RNP复合物在显微注射后立即起作用。若是导入mRNA,还要考虑密码子优化的问题。

 

在利用慢病毒或质粒导入Cas9和sgRNA时,通常利用抗性标记(潮霉素或嘌呤霉素)或报告基因(GFP)来分离成功转导或转染的细胞。在转染RNP复合物时可使用替代报告基因(surrogate reporter)。荧光形式的Cas9(比如Cas9-GFP或Cas9-Cy3)可用来分选RNP转染的细胞。

 

向导RNA的效率和特异性

 

对于同一基因而言,不同sgRNA的表现也许千差万别。目前有许多生物信息学工具可用来设计sgRNA,其中一些工具可对sgRNA进行打分。不过,没有一种工具可以保证sgRNA的效果,因此在可能的情况下,尽量测试多个sgRNA,并利用核酸内切酶切割实验来鉴定sgRNA在体外的切割效果。当然,这不能保证体内有效性,因为还取决于染色质开放性。

 

Cas9的靶向特异性取决于20 nt的sgRNA向导序列以及基因组中与目标序列相邻的PAM的存在。值得注意的是,将sgRNA向导序列缩短至17 nt,可明显提高靶向特异性。许多在线工具可以辅助sgRNA的设计,但预测效果和实际效果往往有很大差异,因为光凭序列同源性不能完全预测脱靶位点。

 

理论上来说,对编辑前后的细胞进行全基因组测序(WGS)分析可无偏向地检测脱靶。不过,WGS本身也面临挑战,可能不适用于脱靶突变的检测。尽管测序成本不断下降,但人们需要一定程度的生物信息学知识来检测小的插入缺失,并将信号和噪声区分开。此外,克隆扩增期间也可能出现许多自发的新突变,无法与脱靶效应区分。

 

为了克服这些限制,人们最近开发了几种方法来检测基因组中Cas9的脱靶活性,比如BLESS(标记DSB后富集和测序)、HTGTS(高通量的全基因组易位测序)、GUIDE-Seq(通过测序实现全基因组内DSB的无偏向鉴定)、Digenome-Seq(体外Cas9消化的WGS)、IDLV(利用整合酶缺陷型慢病毒载体检测脱靶)以及最近的SITE-Seq(鉴定DNA切割位点的生化方法)和CIRCLE-Seq(体外鉴定脱靶突变的方法)等。

 

染色质免疫沉淀(ChIP)是研究蛋白质-DNA相互作用的首选技术。因此,您可以通过ChIP-qPCR来评估dCas9在目标区域的特异性富集,同时还可以将这种方法扩展到ChIP-Seq,实现无偏向的脱靶位点分析。作者认为,基于dCas9的ChIP-PCR/Seq是一种强大的方法,能够快速经济地评估几条sgRNA。不过,没有一种方法能保证完全覆盖脱靶位点,因此理想的方案是结合使用多种方法。

 

展望未来

 

作者认为,若要将Cas9应用于基因治疗,必须要解决几个问题。首先,Cas9核酸酶通常来源于常见的人类病原体。最近的报道称人群对SpCas9和SaCas9已经有免疫力。如何控制Cas9引起的免疫应答,这是一个问题。其次,另一个限制是Cas9比较大,无法包装到腺相关病毒载体中,可以考虑Cas9核酸酶家族的其他成员,比如Cas12a(Cpf1)。此外,Cas13a和CasRx也为基于RNA编辑的新疗法铺平了道路。

 

原文检索

Guidelines for optimized gene knockout using CRISPR/Cas9

BIOTECHNIQUES VOL. 66, NO. 6 REVIEW

 

转载标题:BioTechniques发布优化CRISPR/Cas9实验的指南

 

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【赛业生物科技简介】

作为实力雄厚的基因工程鼠技术平台,赛业生物已服务全球数万名科学家,赛业产品与技术已直接应用于包括CNS(Cell, Nature, Science)三大期刊在内的2400篇学术论文。2016年,TurboKnockout把ES打靶金标准推向新高度;同年,CRISPR-Pro使大片段敲入及条件性基因敲除变得更加高效;2017年,AlphaKnockout基因打靶专家系统首次实现基于人工智能的最优化方案设计;同年7月,推出万例CRISPR-AI敲除小鼠资源库。赛业一步一个脚印,踏实前行,助力中国科研!