CRISPR衍生工具:分离感兴趣的基因组区域

日期: 2019年06月25日


    

尽管大多数的CRISPR研究都集中在基因组编辑上,但近年来人们也利用催化失活的Cas9核酸酶(dCas9)开展了其他领域的探索。他们将转录激活因子(如VP64)或转录抑制因子与dCas9融合来实现转录激活或抑制。不过,将dCas9与蛋白质标签融合也能实现特定基因组区域的分离。

 

反向的ChIP

 

2013年,大阪大学的Hodaka Fujii等人首次描述了如何利用CRISPR系统来分离特定的基因组区域,从而鉴定此位点的分子相互作用。他们将这种方法称为DNA结合分子介导的染色质免疫沉淀(enChIP),因为使用经过改造的DNA结合分子,如锌指蛋白或TAL蛋白。

 

研究人员在哺乳动物细胞中表达了N端融合3xFLAG标签的dCas9(3xFLAG-dCas9)以及靶定转录因子IRF-1启动子区域的sgRNA。之后,利用针对3xFLAG标签的抗体进行免疫沉淀,分离出与dCas9结合的基因组位点,并通过PCR进行确认。最后利用质谱分析鉴定出与IRF-1位点相关联的蛋白质。

 

传统的ChIP是靶定特定蛋白质,鉴定它所在的基因组位点。enChIP是反向的,靶定基因组区域然后鉴定哪种蛋白质在那里。在此之前,分离特定的基因组区域一直是个繁琐的过程,可能需要多个步骤。enChIP系统解决了这些问题,因为它使用gRNA来靶向感兴趣的区域,而gRNA可以轻松克隆到gRNA表达质粒中。

 

改造和应用

 

自从enChIP系统被开发以来,许多实验室已经对它进行了各种各样的改造。除了鉴定DNA结合蛋白外,此方法还可以鉴定特定位点的核酸相互作用。此外,Fujii实验室还生成了转基因小鼠品系和逆转录病毒表达系统,以便在体内研究中使用此方法。

 

除了“细胞内”形式,Fujii实验室还开发出另一种“体外”形式。在这种形式中,将重组dCas9蛋白和合成gRNA组成的CRISPR复合物与片段化的染色质或纯化的DNA文库一起孵育,以便纯化特定的染色质或DNA片段。他们利用与3xFLAG标签融合的dCas9以及生物素化的gRNA,在这种“体外”形式中成功实现了片段分离。

 

除了3xFLAG标签,其他标签也可用来分离感兴趣的基因组区域。德克萨斯大学西南医学中心的研究人员就开发出一种名为CAPTURE的方法。它包括三个关键的组分:1) 带有生物素接受位点的dCas9;2) 将生物素添加到接受位点的生物素连接酶BirA;3) 将生物素化的dCas9引到目的位点的gRNA。

 

CAPTURE系统在体内利用生物素连接酶BirA给dCas9添加生物素标记,然后再利用高亲和力的链霉亲和素来纯化与DNA结合的生物素化dCas9。此系统具有高敏感性和特异性,能够应用在蛋白质组学和染色体构象捕获(3C)技术中,并鉴定多个位点上蛋白质与核酸的结合。

 

除此之外,研究人员纷纷采用包括Protein A、1xFLAG、2xAM和HA在内的标签系统,并利用Cas9抗体进行亲和纯化。这些不同的标签系统和纯化方案给enChIP方法增添了不同的风味。

 

利用CRISPR介导的基因组片段分离,研究人员已在多个生物学领域取得了重要成果。2015年,Fujii实验室将基因组区域的分离与RNA测序相结合,鉴定出与端粒相关的非编码RNA。这些新颖的非编码RNA可能在端粒功能中发挥重要作用。

 

吉林大学附属第一医院和斯坦福大学医学院的研究人员利用CRISPR介导的免疫沉淀,确定了miR483在胰岛素样生长因子(IGF2)基因表达调控中的一个新作用。IGF2在多种人类恶性肿瘤中的表达量增高,而miR483能够与IGF2的启动子相互作用,从而导致印记松弛(relaxation of imprinting)。

 

2018年,Fred Hutchinson癌症研究中心的Stephen Tapscott等人也利用enChIP方法鉴定了DUX4的调节物。DUX4是一种转录调控因子,在不恰当表达时可引起面肩肱型肌营养不良症(FSHD),这种疾病目前无法治愈。他们鉴定出核小体重塑脱乙酰酶(NuRD)和染色质组装因子1(CAF-1)是在人骨骼肌细胞和诱导多能干细胞中抑制DUX4所必需的。

 

人们以CRISPR/Cas9为基础开发了不少衍生工具,CRISPR介导的特定基因组区域的分离正是其中一种。与新一代测序相结合,这种方法能够从单个实验中获得大量数据,有助于提升我们对DNA结合和基因调控的了解。

 

转载标题:CRISPR衍生工具:分离感兴趣的基因组区域

 

本文来自“生物通”,转载的目的在于分享见解。如有侵权,请告知删除!

 

【赛业生物科技简介】

 

作为实力雄厚的基因工程鼠技术平台,赛业生物已服务全球数万名科学家,赛业产品与技术已直接应用于包括CNS(Cell, Nature, Science)三大期刊在内的2400篇学术论文。2016年,TurboKnockout把ES打靶金标准推向新高度;同年,CRISPR-Pro使大片段敲入及条件性基因敲除变得更加高效;2017年,AlphaKnockout基因打靶专家系统首次实现基于人工智能的最优化方案设计;同年7月,推出万例CRISPR-AI敲除小鼠资源库。赛业一步一个脚印,踏实前行,助力中国科研!

  • 招聘
  • 侧边栏广告 - 科研奖励基金计划