Immunity（IF=43）：北大夏朋延等团队解析孤儿受体Nur77如何激活非经典NLRP3炎症小体

为了识别LPS的胞内结合蛋白，研究人员对骨髓来源的巨噬细胞（iBMDM）进行质谱分析。除了caspase-11，还有9种蛋白也是推定的LPS结合对象。之后他们利用CRISPR-Cas技术生成了缺失这些蛋白的iBMDM细胞，发现只有缺失Casp11（编码caspase-1）和Nr4a1（编码核受体Nur77）的细胞在LPS刺激下无法分泌IL-1β，这表明Nur77可能在非经典炎症小体信号通路中起作用。

他们从Nr4a1^-/-小鼠（赛业生物提供）中生成了原代BMDM细胞。在转染LPS后，Nr4a1^-/- BMDM细胞的caspase-1没有活化，而caspase-11或GSDMD活化不受影响。同时，Nr4a1^-/-细胞的IL-1β分泌减少，但细胞焦亡不受影响。这些结果表明，Nur77对非经典NLRP3炎症小体的激活至关重要。

研究人员怀疑，Nur77是胞内LPS的真正传感器。非变性凝胶电泳分析发现，与LPS孵育的Nur77迁移得比单独的Nur77慢，表明这两个分子之间存在直接结合。生物素标记的LPS可在pull-down分析中沉淀重组Nur77，进一步表明Nur77是LPS的胞内受体。此外，他们还确定了Nur77的C端结构域参与了与LPS的结合，缺乏第524-547位氨基酸的Nur77无法与LPS结合。

基于这些结果，研究人员假设Nur77在caspase-11和GSDMD下游的NLRP3炎症小体激活中发挥了作用。为了研究具体的分子机制，他们开展了酵母双杂交实验，证实Nur771-287与NLRP3的LRR结构域存在相互作用。在HEK293T细胞中，他们通过免疫共沉淀实验观察到Nur771-357与全长NLRP3结合，但没有观察到全长Nur77与全长NLRP3的结合。经过一系列实验，他们发现只有在LPS和包含NBRE的dsDNA存在时，Nur77才能与NLRP3结合（图1）。在受到LPS刺激的BMDM细胞中，他们通过免疫荧光染色观察到Nur77和NLRP3是共定位的。

Nur77在LPS和dsDNA存在时与NLRP3结合^[1]

那么，这个dsDNA的来源是不是线粒体？为了确定GSDMD是否能够导致巨噬细胞中线粒体DNA的释放，研究人员将LPS转染到BMDM细胞中，并对各个细胞组分进行分离。结果表明，裂解的GSDMD存在于线粒体部分，且释放到胞质中的线粒体dsDNA增加。同时，线粒体DNA的耗尽会导致BMDM细胞在LPS刺激后的NLRP3炎症小体激活减少。在Nr4a1^-/- BMDM细胞中，若释放线粒体DNA的通道被抑制，则非经典NLRP3炎症小体的激活受到影响。这些结果表明，GSDMD在线粒体上打孔，将线粒体DNA释放到胞浆中，这对于Nur77的活化至关重要。

考虑到GSDMD在非经典NLRP3炎症小体的激活中起着关键作用，他们利用Gsdmd^-/- BMDM细胞开展实验，以确定Nur77与NLRP3之间的关系。他们发现，Gsdmd^-/-细胞在受到LPS刺激后，Nur77不再与NLRP3结合，也未观察到Nur77与线粒体DNA的结合。同样地，在Casp11^-/- BMDM细胞中，Nur77与NLRP3之间的结合也受到影响（图2）。因此，Nur77需要caspase-11来加工GSDMD以激活非经典的NLRP3炎症小体。缺乏DNA结合域或LPS结合位点的Nur77不能促进NLRP3的激活。

Nur77对NLRP3的激活依赖caspase-11和GSDMD^[1]

最后，研究人员分析了Nur77在脓毒症中的作用。他们用poly（I：C）对野生型、Nr4a1-/-、Nlrp3-/-和Casp11-/-小鼠（赛业生物提供）进行预处理后注射LPS，发现Nr4a1^-/-小鼠血清中的IL-1β水平降低，与Nlrp3^-/-小鼠相似。分离小鼠的腹膜巨噬细胞后发现，Nr4a1缺失不影响细胞焦亡。在注射致死剂量的LPS后，Nr4a1^-/-小鼠存活时间更长。这些结果表明，Nur77会加剧宿主对内毒素的反应。

Nur77与LPS结合激活非经典NLRP3炎症小体的示意图^[1]

总的来说，这项研究表明Nur77作为细胞内的LPS传感器，与线粒体DNA和LPS结合，激活非经典NLRP3炎症小体通路（图3）。作者认为，Nur77为caspase-11的激活和下游NLRP3炎症小体的形成搭建了桥梁，有望为炎症性疾病和脓毒症的治疗提供靶点。