IF=44丨贾怡昌/高召兵/樊东升团队发现科学界长期寻找的内质网阴离子通道

之前的研究发现，内质网驻留蛋白CLCC1的缺失会造成内质网胁迫和神经退行性变。不过CLCC1与氯离子通道CLIC家族成员的序列相似性很小。在此次研究中，研究人员证实CLCC1定位在内质网膜上，并形成了同源二聚体。将纯化的全长mCLCC1蛋白加入脂质双分子层后，他们发现CLCC1可以介导阴离子流，但不通透纳、钾、钙等阳离子。这表明，CLCC1是阴离子通道的孔道形成组分。

研究人员进一步分析后发现，内质网腔内的高浓度钙离子会抑制CLCC1通道的活性。为了确定负责钙离子抑制的关键残基，他们对N端几个保守的带负电残基进行了分析，发现D25和D181是负责CLCC1通道的钙离子抑制活性的关键残基。D25E/D181R突变的CLCC1会显著破坏与钙离子的结合亲和力。

为了研究CLCC1是否参与调节内质网的离子稳态，研究人员使用了内质网定位的比率型氯离子探针（RaMorideER）和比率型钾离子探针（RaMssiumER）。他们发现，在敲低293FT细胞的CLCC1后，内质网中的静息态氯离子浓度（[Cl^–]_ER）和钾离子浓度（[K⁺]_ER）升高。通过透射电镜（TEM）观察，他们发现对照组的内质网呈现细长结构，而CLCC1敲低后内质网则呈现短而粗的形态，且内质网的平均宽度增加（图1）。这些结果表明，CLCC1维持着内质网中氯离子和钾离子浓度以及内质网的形态。

CLCC1的缺失导致静息态[Cl^–]_ER和[K⁺]_ER升高以及内质网肿胀^[1]

接着，研究人员分析了CLCC1作为内质网的氯离子通道是否参与调节钙离子的释放。他们发现，CLCC1的敲低不仅显著降低了ATP诱导的钙离子释放幅度和速度，还削弱了细胞质中的钙震荡。后续的分析表明，CLCC1的敲低以剂量依赖性的方式增加了内质网中的钾离子浓度和内质网容量，并降低了钙离子浓度，说明CLCC1的剂量对于维持静息态钙离子浓度（[Ca²⁺]_ER）至关重要。

作为许多离子通道的必要辅因子，细胞膜上的酸性磷脂PIP2参与了离子通道功能的调节。在此，研究人员也发现，PIP2显著促进了CLCC1通道的活性，而CLCC1第二个环内的保守残基K298是关键的PIP2结合位点。突变体K298A和K298E降低了CLCC1的电导率和开放概率。K298A基因敲入小鼠的大脑表现出内质网胁迫，而且脊髓中ChAT+运动神经元数量减少，并表现出严重的运动障碍和后腿肌肉无力，这表明K298A突变对通道功能的破坏会促进内质网胁迫和运动神经元丢失。

通过中国ALS患者队列的外显子组测序分析，研究人员发现了CLCC1的8个罕见变异，包括S263R和W267R。与对照相比，带有S263R或W267R突变的CLCC1增加了内质网中的氯离子浓度，表明S263R和W267R是功能上的有害改变，会破坏通道活性。同时，突变会显著减少ATP诱导的钙离子释放。在S263R和W267R基因敲入小鼠中，研究人员还观察到错误折叠蛋白在丘脑和脊髓中积累，显示了突变神经元更容易出现内质网胁迫。

S263R和W267R突变破坏CLCC1通道功能并促进内质网胁迫^[1]

多个Clcc1功能缺失等位基因的表型比较显示，体内疾病表型的严重程度与CLCC1的剂量有关。10%的K298A杂合小鼠出现了类似ALS的症状，表明功能缺失突变以显性失活的方式诱导了离子通道病。在敲除脊髓ChAT+运动神经元中的Clcc1后，小鼠出现运动神经元减少、内质网胁迫、错误折叠蛋白积累以及脊髓ALS特征性病变。

总的来说，研究人员首次确定CLCC1是内质网定位的氯离子通道的孔道形成组分，其通道活性受到腔内钙离子的抑制，但受到PIP2的促进。他们还首次将罕见的CLCC1突变与ALS联系起来，并证明ALS相关突变会破坏CLCC1通道活性，破坏内质网的离子稳态，并引发大脑中的内质网胁迫。这些结果意味着，由CLCC1维持的内质网离子稳态的破坏是造成神经退行性疾病的原因之一。