IF=24.5丨南方医科大学团队发现AKK来源的新型三肽对致死性脓毒症的保护作用

首先，研究人员对假手术和盲肠结扎穿刺法（CLP）构建的脓毒症小鼠的粪便进行了2bRAD-M测序，以探索肠道微生物群与脓毒症发生和发展之间的潜在联系。

在种水平上，与假手术组相比，CLP组的粪便中AKK丰度降低（图1 A），随后荧光定量PCR检测中小鼠粪便中AKK的相对丰度也验证这一发现（图1 B）。重要的是，与小鼠模型一致，如图1 C所示，61份脓毒症患者粪便样本的AKK丰度明显低于27份对照样本。为了阐明AKK在脓毒症进展中的作用，作者将高AKK和低AKK两组人类粪便移植到受体小鼠中并进行CLP手术。有趣的是，接受高AKK丰度粪便的小鼠的存活时间往往略高于接受低AKK的小鼠（图1 E），尽管其他细菌也可能参与脓毒症的进展，但这些数据表明，AKK细菌至少在一定程度上发挥了保护作用。因此，肠道AKK水平可能参与脓毒症的进展。

接下来，为了确定AKK对脓毒症的直接影响，作者用PBS、活AKK或死AKK处理小鼠，然后进行假手术或CLP手术。图1 F-H提示，活AKK，而不是灭活AKK可以减轻脓毒症引起的器官损伤和致死性。上述数据表明，AKK的保护作用可能取决于活细菌产生的生物活性物质。然后，作者评估了来自活AKK的培养上清液是否能缓解脓毒症。图1 I-K提示，与对照相比，自活AKK的培养上清液可以减轻脓毒症引起的器官损伤和致死性。LPS诱导的脓毒症模型中的数据同样验证了上述观点（图1 L-O）。总之，这些发现清楚地表明，活的AKK可能通过产生保护性物质，在小鼠模型中有效地挽救了致命性脓毒症。

图1 肠道AKK在小鼠模型中对致命性脓毒症具有保护作用^[1]

为了进一步探索活AKK分泌的保护性物质，作者对空白培养基和活AKK培养基的培养上清液进行了非靶向代谢组学分析，发现一种新的三肽RKH在活的AKK上清液中显著富集，并在非靶向代谢组学分析中表现出最大的倍数变化（图2 C-D）。靶向验证揭示RKH在活AKK培养基显著高表达（图2 E），且在脓毒症病人中RKH含量显著下降（图2 H）。

重要的是，作者引入赛业生物提供的无菌（germ free）小鼠并对其进行AKK菌定植，发现AKK菌定植组小鼠中血浆和盲肠内容物RKH含量显著回升（图2 F-G）。为了探索RKH对致命性脓毒症的潜在治疗作用，在CLP手术前/ LPS注射前给小鼠服用RKH，结果提示（图2 I-O），AKK活性产物RKH可以在小鼠模型中预防致命性脓毒症。

图2 活AKK产生的Arg-Lys-His（RKH）对小鼠致命性脓毒症的保护作用^[1]

就细胞因子风暴而言，系统性炎症是脓毒症发病期间死亡的主要因素之一。作者对Sham对照组，CLP组以及CLP+RKH处理组的小鼠腹腔灌洗液进行转录组学分析。结果显示RKH处理后，与CLP组相比其中全基因表达发生改变，且其中的炎症因子表现下降趋势（图3 A-B）。进一步的，研究人员发现活AKK，AKK培养上清以及RKH处理能够明显降低系统性炎症反应以及腹腔巨噬细胞富集（图3 C-G）。此外，细胞体外刺激的结果显示RKH能够降低LPS诱导的多种巨噬细胞促炎反应。综上，RKH可能通过抑制脓毒症引起的系统性炎症发挥保护作用。

图3 RKH预防脓毒症引起的系统性炎症反应^[1]

TLRs在脓毒症进展过程中对入侵病原体的系统反应起着重要作用。图4 A-B提示，RKH能够显著抑制巨噬细胞中TLR4下游的信号转导。作者使用FITC荧光素标记的LPS处理巨噬细胞，发现RKH能够显著抑制LPS的结合（图4 C）。结合上述结果，作者猜测RKH能够与LPS竞争性结合TLR4，并通过表面等离子共振技术（图4 D），酶解实验（图4 E），热稳定实验（图4 F）和分子对接技术（图4 I）验证了此观点。

更重要的是，免疫沉淀（IP）实验的数据显示，RKH是通过抑制TLR4-MD2和TLR4-TLR4的二聚化来实现对TLR4下游信号转导的抑制（图4  G-H）。此外，根据分子对接结果提示的RKH结合位点进行突变的实验结果提示TLR4上的ARG264、LEU293、ASP294和LYS362可能是RKH抑制TLR4二聚的潜在功能结合位点。最后，作者引入TLR4^-/-小鼠对上述观点进行验证。小鼠进行CLP手术后，RKH对生存率，脏器损伤和系统性炎症反应没有保护作用。这些结果表明，RKH对致命性脓毒症的保护作用，至少部分是通过抑制TLR4信号传导而发生的。

图4 RKH直接靶向TLR4并阻断TLR4激活^[1]

为了进一步扩大RKH在临床上治疗脓毒症的潜力，作者采用了巴马猪脓毒症大动物模型。图5提示，在巴马猪脓毒症模型中，RKH处理能够显著延长生存率，降低血清中多种损伤指标，缓解多脏器损伤以及减弱炎症反应。

图5 RKH延长脓毒症巴马猪模型的存活时间并减少过度炎症和器官损伤^[1]

最后，为了进一步评估RKH对人类免疫细胞促炎活性调节的效力，从脓毒症患者中提取外周血单核细胞，并在体外分化为巨噬细胞。图6 A提示，RKH能够显著降低巨噬细胞IL-6的mRNA水平。此外，RKH不影响脓毒症患者淋巴细胞正常功能（包括凋亡和细胞因子产生）。

图6 RKH负调控脓毒症患者巨噬细胞的促炎活性^[1]

综上所述，该研究提供了脓毒症发展背景下宿主-微生物群落的相互作用的新证据。作者通过揭示活AKK产生的一种新的生物活性三肽RKH，扩展了活AKK的病理生理作用。如果在未来的临床实践中对脓毒症能够发挥保护作用，尤其是对处于高炎症状态的患者，RKH可能是致命性脓毒症的潜在有效治疗方法。