Nature子刊│哈尔滨医科大学孙备团队发现肠道菌群在高甘油三酯血症性胰腺炎的作用机制

HTGP患者中肠道菌群变化[1]

为研究HTGP患者特异性菌群差异，研究人员比较三组人群样本肠道菌群间的菌群丰度差异。相较于健康人群（HC）组，HTGP患者肠道菌群的α多样性显著降低（图1a），β多样性显示 HTGP、HTG及HC人群的肠道菌群组成与结构具有显著差异（图1b）。基于属、种水平分析，研究团队发现HTGP患者的肠球菌及大肠埃希菌等条件性致病菌丰度显著上调，而 Faecalibacterium prausnitzii，Faecalibacterium，Bacteroides uniformis 等有益菌丰度丰度显著下调（LDA>4, P<0.05）（图1d-f）。其中肠道菌群与HTGP病情严重程度具有相关性，如：Bacteroides uniformis及Bacteroides vulgatus与系统性并发症发生呈负相关（图1g），上述结果揭示了肠道菌群标志物在HTGP诊治中的临床价值。

肠道菌群紊加重HTGP进展[1]

为明确是否肠道菌群变化直接导致HTGP进展，研究人员利用FMT构建菌群人源化小鼠模型，并对FMT后各组小鼠进行病理学相关检测。结果显示：相较于移植健康人群组，移植HTGP患者粪便（FMT-HTGP）组小鼠的胰腺损伤程度、炎症指标（淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-1β）水平均显著升高（图2a-c）。16S检测发现FMT-HTGP组肠道菌群的α多样性显著降低（图2d），β多样性显示三组肠道菌群组成与结构具有显著差异（图2e）。基于种水平分析， Bacteroides uniformis同样在FMT-HTGP组中显著下调（P<0.05）（图2f-g）。

肠道菌群通过调控胰腺NETs形成缓解HTGP进展[1]

为证明肠道菌群对HTGP胰腺组织免疫细胞的调控，流式细胞术发现FMT-HTGP组小鼠胰腺中性粒细胞的募集与活化显著增强，CD45+Ly6g+细胞比例升高（图3a）。进一步利用免疫组化比较胰腺组织中性粒细胞的表达与分布，结果提示：Ly6g在FMT-HTGP组中表达显著上调（图3b）。转录组测序显示差异mRNA表达数据进行功能预测分析，提示FMT-HTGP组胰腺中的白细胞活化、中性粒细胞浸润及中性粒细胞脱颗粒等功能富集显著上调（图3b, d）。单细胞数据经过t-SNE降维聚类、差异表达基因分析，研究人员通过细胞注释获得13类细胞（图3e），同样印证了中性粒细胞在FMT-HTGP组中占比明显升高（图3f）。Cxcl2、Il23a、Ccl6、Ccl21等介导中性粒细胞趋化的基因在FMT-HTGP组上调，并发现介导NETs形成的关键基因Padi4、Cd177、MPO等在FMT-HTGP组中同样显著上调（图3g）。GSEA分析提示，相较于FMT-HC组，FMT-HTGP组中性粒细胞的NETs通路富集评分及其激活的关键基因更高（图3h, i）。提取两组小鼠外周血中性粒细胞，细胞染色SYTOX观察NETs形成差异，显示FMT-HTGP组NETs形成明显增强（图3j），胰腺组织内同样证实FMT-HTGP中NETs激活明显增强（图3k-l）。

Bacteroidesuniformis通过抑制NETs形成来缓解HTGP[1]

B.uniformis在HTGP患者和FMT-HTGP组明显降低（图4a-b）。为探究B.uniformis是否通过中性粒细胞发挥作用，研究者进行B.uniformis灌胃而后构建HTGP模型。结果发现：B.uniformis缓解HTGP胰腺损伤（图4c），减轻HTGP炎症反应。B.uniformis干预可缓解HTGP病程中胰腺中性粒细胞的过度募集及胰腺NETs形成（图4d, e）。

此外，研究人员对抗生素处理后的Gpihbp1^-/-敲除鼠（赛业生物提供）构建HTGP模型进行B.uniformis干预（图4b），结果提示：相较于对照组小鼠，单菌干预组（B.U+HTGP）组小鼠的胰腺损伤程度、炎症指标等均显著降低（图42f, g）。进一步分析发现，在Gpihbp1^-/-敲除鼠中，B.uniformis同样有效抑制了中性粒细胞的募集与NETs的形成。CD45与Ly6g、CitH3与MPO免疫荧光双染证实，B.U+HTGP组胰腺组织中性粒细胞的募集与NETs形成显著减少（图4h-k）。综上，研究者发现B.uniformis可通过抑制中性粒细胞浸润及NETs形成，进而缓解HTGP。

Bacteroidesuniformis衍生牛磺酸可缓解HTGP[1]

在FMT试验中，研究人员分别对FMT-HC组与FMT-HTGP组血浆样本进行非靶向代谢组学测定，结果提示：粪便牛磺酸在FMT-HC组中表达水平升高（图5a），ELISA证实代谢组学结果（图5b），菌群-代谢相关性分析提示：B.uniformis可能通过促牛磺酸合成延缓HTGP进展（图5c）。在单菌试验中氨基酸靶向代谢组学测定，结果提示：粪便牛磺酸在B.U+HTGP组中表达水平升高（图5d），ELISA检测B.U+HTGP小鼠血浆牛磺酸水平同样高于对照组（图5e）。基于多组学研究结果，研究人员发现牛磺酸是肠道菌群缓解HTGP进展的关键代谢产物，随即验证牛磺酸在HTGP中的缓解作用（图5f）。相较于对照组（HTGP），给予HTGP小鼠牛磺酸饮用水干预周后，牛磺酸干预组（Tau+HTGP）小鼠胰腺损伤明显缓解（图5g），中性粒细胞比例表达下调（图5h），NETs形成显著减少（图5i, j）。

此外，研究人员对Gpihbp1^-/-敲除鼠同样进行验证，证实牛磺酸干预组（B.U+HTGP）组小鼠的胰腺损伤程度显著降低（图5k）,中性粒细胞比例表达下调（图5l），NETs形成显著减少（图5m, n）。综上，研究者发现牛磺酸是B.uniformis干预后的关键菌群代谢产物，其可能通过肠屏障进入至血循环及胰腺组织中，依赖于中性粒细胞及NETs发挥抗炎作用。

牛磺酸通过抑制NETs形成缓解HTGP[1]

PAD4是NETs形成的关键基因，Pad4基因敲除小鼠（Pad4^-/-）是公认的NETs缺陷模型。为验证牛磺酸与HTGP病程中NETs形成的直接相关性，研究者利用Pad4敲除小鼠（赛业生物提供）构建HTGP模型，并分别予以牛磺酸或无菌水分别干预，共分为HTGP、Pad4^-/-+HTGP、Tau+Pad4^-/-+HTGP三组（图6a）。首先，研究人员发现抑制NETs形成可明显缓解HTGP进展，而对于Pad4^-/-小鼠构建的HTGP模型，牛磺酸干预并未起到明显的缓解作用（图6b-e）。此外，免疫荧光分析提示，Pad4^-/-+HTGP组小鼠胰腺组织及外周血中性粒细胞的活化和NETs形成显著减轻，而对牛磺酸干预对此小鼠无明显缓解作用（图6f）。同样，研究人员提取各组小鼠外周血中性粒细胞并观察体外NETs形成印证上述结论（图6j-i）。综上，研究人员进一步利用了Pad4敲除鼠构建HTGP-NETs缺陷模型，从动物水平证实牛磺酸对于HTGP病程中NETs形成的直接抑制作用。

明确B.uniformis及牛磺酸在HTGP患者中的作用[1]

基于上述研究，研究人员发现B.uniformis促牛磺酸合成抑制NETs形成在HTGP中的重要作用。为进一步明确上述菌群、代谢、免疫节点在HTGP诊治中的重要临床价值，研究者收集20名健康志愿者及30名HTGP患者临床血液样本并进行相关性分析（图7a）。血清ELISA证实健康人群的NETs水平显著低于HTGP患者，同时NETs水平与HTGP严重程度成正相关；健康人群的牛磺酸水平显著高于HTGP患者，与NETs水平呈显著负相关（图7b-c），B.uniformis丰度与血清牛磺酸水平呈正相关（图7b, d）。

进一步研究发现，健康人群外周血中性粒细胞无明显NETs表现，而HTGP患者外周血可见明显NETs形成，提取HTGP患者外周血提取的PMN进行牛磺酸干预，发现HTGP+Tau组体外NETs形成明显减少（图7e）。此外，研究者提取小鼠外周血中性粒细胞，PMA体外诱导NETs形成，同时加入HC人群与HTGP患者血浆上清进行体外共培养，结果发现：相较于PMA诱导NETs形成组，健康人血清干预组NETs缓解，而HTGP患者血清干预组NETs并未缓解（图7f）。相较于PMA体外诱导NETs组，牛磺酸处理可导致中性粒细胞内磷酸化NF-κB蛋白水平显著降低（P<0.05），同时NF-κB和IL-17A的mRNA水平降低（图7g-i）。综上，研究人员从临床样本中证实了B.uniformis、牛磺酸、NETs形成的相关性，并进一步验证了健康人血清对NETs形成的缓解作用及牛磺酸抑制NETs形成的确切机制，发掘了B.uniformis及牛磺酸在HTGP治疗中的临床价值。

该研究发现高甘油三酯血症性胰腺炎（HTGP）患者肠道单形拟杆菌（B.uniformis）丰度下调，导致其代谢产物牛磺酸水平降低，进而通过激活NF-κB、IL-17信号通路及促进结肠IL-17释放加速胰腺中性粒细胞胞外捕获网形成（NETs），最终加剧HTGP胰腺损伤。