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利用β5i基因敲除小鼠和β5i基因过表达小鼠进行体内实验验证


    

原文标题:The immunoproteasome catalytic 5i subunit regulates cardiac hypertrophy by targeting the autophagy protein ATG5 for degradation

期刊:SCIENCE ADVANCES

影响因子:12.804(2018年)

发表时间:2019年5月8日

选用服务:心脏特异性β5i转基因(β5i-Tg)小鼠

 

研究背景:

 

心脏衰竭是各种心脏病的最后阶段,是全世界发病率和死亡率的一个主要原因。慢性心脏衰竭的两个特征是心脏肥厚和存活心肌收缩力降低。心脏肥厚是心脏对病理刺激(包括高血压、心肌梗死、肾素-血管紧张素系统的激活)的一种重要的适应性反应。虽然肥厚反应可能会在一段时间内维持心脏功能,但长时间的肥大会变得有害,导致心功能不全和心力衰竭(HF)。

 

 

心肌肥大涉及蛋白质合成和降解平衡的改变,而且,在这个过程中涉及的基因和信号转导途径的鉴定方面已经取得了重大进展。近年来,泛素-蛋白酶体系统(UPS)在心脏重塑过程中的重要性得到了报道。免疫蛋白酶体在炎症性疾病的调节中具有多种病理生理功能。最近的研究表明免疫蛋白酶体亚基,如β2i和β5i,通过不同的机制参与几种心血管疾病(例如肠病毒心肌炎、AngⅡ诱发的心房颤动等)的调控。然而,β5i在调节心脏肥大方面的作用仍然是未知的。

 

研究思路:

 

功能获得和缺失(gain-and loss-of-function)实验

 

Step 1 基因芯片技术、统计学分析

利用基因芯片技术对受损心肌中的蛋白酶体亚基表达谱进行鉴定,发现在野生型小鼠中诱导严重的心肌肥厚后β5i的表达显著上调。qPCR分析,β5i的mRNA水平显著升高。在心力衰竭病人的样本切片中也可以发现,β5i表达量明显升高。以上结果和一系列统计学分析都表明β5i在心肌肥厚的调节中起着重要的作用

 

肥厚心脏

图1.肥厚心脏和心衰患者中的β5i表达升高

 

Step 2 在原代心肌细胞中敲低β5i

结合化学遗传技术,敲低β5i减弱了Ang II诱导的心肌细胞大小的增加,以及心房利钠因子(ANF)和BNP的表达。β5i对苯肾上腺素处理的心肌细胞的影响,与Ang II处理细胞的数据一致。这些数据表明敲低β5i在体外能抑制心肌细胞肥大。

 

Step 3 化学遗传技术

 

有越来越多的证据表明,蛋白酶体被抑制后会通过上调自噬信号通路来补偿。因此,作者们想要知道,敲低β5i后对于自噬信号途径有什么影响。作者们发现敲低β5i后能够促进自噬的发生,并且自噬的抑制逆转了β5i敲低的保护作用。

 

自噬抑制心肌细胞

图2.敲低β5i通过自噬抑制心肌细胞大小

 

Step 4 利用β5i基因敲除小鼠和β5i基因过表达小鼠进行体内实验验证

 

为了检测ATG5依赖性自噬是否介导β5i缺失对心脏肥大的抑制作用,研究人员rAAV9-siRNA注射WT或β5iKO小鼠以敲低内源性ATG5表达。通过免疫共沉淀的实验,作者们发现β5i与ATG5能够发生相互作用,并且β5i能够促进ATG5蛋白的降解。

 

在小鼠和原代心肌细胞中敲除β5i基因,表明敲除β5i基因可以减轻心脏肥厚;相反,β5i的过表达加重了这种影响,证明了β5i的促肥大作用。

 

心脏特异性的β5i

图3.心脏特异性的β5i过表达加重了压力超负荷引起的心脏肥大

 

结论:

 

总而言之,研究人员发现了免疫蛋白酶体亚基β5i在病理性心肌细胞肥厚中的重要作用。β5i通过靶向ATG5的降解从而抑制自噬的活性,在血管紧张素诱导的心肌肥厚中作为重要的正向调节因子。同时作者们还发现了病理性肥厚的心肌细胞中免疫蛋白酶体与自噬之间必不可少的代偿性联系,为进一步的解决心力衰竭等疾病提供了新的治疗方案与思路。

 

【赛业生物科技简介】

作为实力雄厚的基因工程鼠技术平台,赛业生物已服务全球数万名科学家,赛业产品与技术已直接应用于包括CNS(Cell, Nature, Science)三大期刊在内的2700余篇学术论文。2016年,TurboKnockout把ES打靶金标准推向新高度;同年,CRISPR-Pro使大片段敲入及条件性基因敲除变得更加高效;2017年,AlphaKnockout基因打靶专家系统首次实现基于人工智能的最优化方案设计;同年7月,推出万例CRISPR-AI基因敲除小鼠资源库。赛业一步一个脚印,踏实前行,助力中国科研!