想了解细胞产品及试剂相关内容,请点击这里进入OriCell网站
  • 从困境到方案,眼科基因治疗解决方案,助力眼科新药临床开发!

长链非编码RNA——国自然基金中的研究热点

近10年,长非编码RNA(Long noncoding RNAs, lncRNA)的研究热度节节攀升。国自然项目中,lncRNA的中标项目数也不断增加,成为国自然数一数二的热点之一。如果你对2020年的国自然申请还没有方向,那么这个热点值得你考虑一下。

 

以lncRNA为关键词,lncRNA历年中标项目数

图1. 以lncRNA为关键词,lncRNA历年中标项目数

(来源: medsci.cn)

 

lncRNA,是指长度大于200核苷酸的非编码RNA。大量研究表明,lncRNA参与了从基因表达到蛋白质翻译和保持蛋白稳定等细胞机制,在发育、机体内平衡和维持细胞命运中发挥重要作用,lncRNA的异常表达与包括癌症和心血管疾病等多种疾病密切相关,因此提供了新的生物标志物和药物靶点。

 

 lncRNA参与基因表达调控,可以通过多种类型的lncRNA调控来调节基因表达

图2. lncRNA参与基因表达调控,可以通过多种类型的lncRNA调控来调节基因表达

 

随着高通量测序、lncRNA芯片等技术的发展,越来越多的 lncRNA被鉴定出来,但具体的作用与功能仍然不是很清楚。通过不断发现新的lncRNA以及对已知lncRNA进行更彻底的表征研究可能会丰富lncRNA的分子机制及生物功能,因此 lncRNA依然具有极大的研究价值。

 

研究lncRNA的经典策略

 

1. 筛选lncRNA

 

通过lncRNA芯片或RNA测序等方法对样本进行高通量筛选。

 

2. 表达分析

 

筛到表达差异最显著的lncRNA,通过qPCR或RNA原位杂交对候选lncRNA验证,检测lncRNA在不同细胞或者组织中的表达水平和定位。

 

3. 功能研究

 

研究基因功能的常规策略是用功能获得/缺失实验进行表型分析,通过细胞和动物实验进行验证。

 

4. 机制研究

 

lncRNA可与蛋白质、DNA和RNA相互作用,实现多样化功能。因此,可通过与其互作的分子探讨其功能与作用机制:

 

A. 与蛋白质相互作用:鉴定lncRNA的蛋白质伴侣可为其功能机制和途径提供线索。例如RNA免疫沉淀(RIP)技术与高通量测序结合使用,以鉴定与lncRNA相互作用的全部宿主蛋白质因子,尽管需要通过机理研究进一步验证。

 

B. 与DNA/RNA相互作用:已有多种技术被用来鉴定lncRNA靶向的基因组位点。基于染色质免疫沉淀(ChIP)和RIP的原理,染色质RNA免疫沉淀(ChRIP)可用于鉴定与特殊染色体标签相互作用的RNA。另一方面,可通过ChOP、ChIRP、CHART等技术使用标记的互补寡核苷酸来鉴定与目标RNA相互作用的DNA位点。

 

C. 结构特征:lncRNA可以形成特定的二级(碱基配对)和三级(三维)结构来执行其功能。可采用RNase footprinting,Chemical Mapping,in-line Probing和SHAPE (selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension)等技术研究其功能域。

 

研究lncRNA作用机制的方法

图3. 研究lncRNA作用机制的方法

 

客户研究案例分析

 

原文标题:Lnc-mg is a long non-coding RNA that promotes myogenesis

 

期刊:Nature Communications

 

研究策略:

 

Step 1 lncRNA筛选

 

研究人员通过芯片筛选、不同的肌肉组织的表达鉴定以及mRNA的功能富集实验后,研究人员找到了与肌细胞生成相关的lncRNA,命名为lnc-mg。

 

芯片筛选肌生成相关的lncRNA以及验证

图4. 芯片筛选肌生成相关的lncRNA以及验证

 

Step 2 lnc-mg功能分析

 

敲减和过表达(体外实验)

 

对lnc-mg进行敲减和过表达。结果显示,敲减后,MuSCs的分化受到抑制,其分子标志MyHC表达降低,肌小管数量减少;过表达后,MuSCs分化加强,肌小管数目增加。

 

lnc-mg的敲减和过表达

图5. lnc-mg的敲减和过表达

 

体内实验

 

研究人员构建了lnc-mg敲除小鼠模型和转基因TG模型,分别检测腓肠肌(GAS),比目鱼肌(SOL),伸缩肌(EDL)和胫骨前肌的形状变化,检测发现lnc-mg敲除小鼠的肌肉重量变轻,体积变小,而TG小鼠的肌肉组织变重变大;此外,两种肌肉的僵直机能和运动能力也完全相反。这些体外和体内实验验证了lnc-mg是影响肌生成的重要lncRNA。

 

lnc-mgskl -/-小鼠的形态学和功能变化

图6. lnc-mgskl -/-小鼠的形态学和功能变化

 

lnc-mg转基因小鼠导致肌肉肥大

图7. lnc-mg转基因小鼠导致肌肉肥大

 

Step 3 lnc-mg机制研究

 

通过miRNA芯片筛选,从ceRNA角度进行验证。

 

通过芯片检测了过表达和敲减细胞的miRNA表达变化,发现miR-125b在过表达细胞中下调,在敲减细胞中上调。结合生物信息学结果分析得出:miR-125b是lnc-mg实现ceRNA机制的潜在靶点。此外,荧光素酶检测也证实了lnc-mg能结合miR-125b并影响其表达。

 

目前已有研究显示,miR-125b通过调控靶基因Igf2影响成肌细胞分化。因此,研究人员检测了过表达和敲减lnc-mg细胞中Igf2的表达,Western Blotting和ELISA结果表明Igf2蛋白表达分别增加和减少。进一步的荧光素酶和小鼠转基因模型实验也都清晰地表明,lnc-mg是通过竞争性地结合miR-125b影响Igf2的表达,从而影响肌细胞生成。因此,lnc-mg是通过典型的ceRNA机制影响肌生成。

 

相关阅读

肠道微生物:你必须了解的国自然研究热点

模式动物资质证明:助力新型冠状病毒肺炎基金申请

 

赛业生物

 

国自然标书倒计时,你的申报书准备充分了吗?

 

赛业生物成熟稳定的基因编辑技术平台每年构建各类基因敲除载体基因敲除细胞模型、基因敲除小鼠模型上万例。从“敲除载体”、“敲除细胞模型”到“敲除大小鼠模型”,赛业生物经验丰富的技术团队可为您提供专业的一站式服务。大战在即,赛业生物一站式服务平台可为您免费提供权威且能清晰说明动物或细胞模型构建技术、周期与预算的证明文件,让您的申报更具说服力。如有需要,欢迎联系我们~

 

联系我们:

400-680-8038

18988965885(微信同号)

info@cyagen.com

www.cyagen.com

 

参考文献:

1. Fernandes J C R, Acuña S M, Aoki J I, et al. Long non-coding RNAs in the regulation of gene expression: physiology and disease[J]. Non-coding RNA, 2019, 5(1): 17.

2. Kung J T Y, Colognori D, Lee J T. Long noncoding RNAs: past, present, and future[J]. Genetics, 2013, 193(3): 651-669.

3. Zhu M, Liu J, Xiao J, et al. Lnc-mg is a long non-coding RNA that promotes myogenesis[J]. Nature communications, 2017, 8(1): 1-11.

如果您对产品或服务有兴趣,可通过以下方式联系我们
在下方表单
填写需求描述给我们
点击页面右侧“在线咨询”
工具快速咨询
拨打免费电话:
400-680-8038
发送邮件至邮箱:
info@cyagen.com
click to refresh