小鼠模型在研究人病毒感染性疾病中的应用

一、应用小鼠模型研究人病毒感染性疾病的意义与优势？

2019年12月以来，新型冠状病毒流行事件再次告诉我们，由人致病性病毒引起的感染性疾病，仍然是当前全球公共卫生安全与经济发展的巨大威胁。世界卫生组织发布的《2007年世界卫生报告》曾指出，自1967年以来，至少有39种新的病毒病原体被发现，包括艾滋病病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒和SARS病毒。同时，大流感、疟疾和结核病等传统疾病不断产生变种、增加抗药性，由于人类卫生保健制度发展仍不完善，这些传统疾病继续对人类健康构成威胁。因此，不断努力研究与探索病毒感染性疾病的致病机制，预防病毒感染传播、研发特异性疫苗与抗病毒药物的新策略，仍是当前生物医药研究领域非常重视与关注的研究领域。

我们知道，应用人群研究病毒感染疾病存在明显的局限性：1. 遗传背景多样性的人群对某些病毒的敏感性差异较大，表现为一些人对某个病毒非常易感，而有些人却完全不易感，或者只表现非常轻的病症或无症状。这种反应不一致现象，可被解释为人体或病毒遗传特征上的差异，包括个体健康状况或人群因素（比如年龄或性别等）。2. 人群过去暴露该病毒的情况，虽然机体已存在针对该病毒的免疫保护作用，但有时候仍然可见相应的免疫病理变化。3. 人群自然感染过程中，有许多影响因素是非常难以控制的，比如病毒感染剂量、过去感染相关病毒史等。4. 伦理方面的限制，很难直接获取病毒感染病人的相关组织器官，开展致病过程病理机制方面的分析研究。5. 应用人细胞体外简单培养的系统研究，很难准确模拟体内病毒与宿主之间相互作用的复杂网络体系。6. 新疫苗与药物的安全性和有效性评价也不适合直接进行人体试验。

因此，为了更好地研究病毒感染性疾病中的致病机制，以及有效评价潜在疫苗与治疗方法的安全性与有效性，实验动物模型就成为研究者们必不可少的研究工具。实验动物模型的优势在于，不仅可事先设计实验目的与策略方法，尽可能排除可能干扰实验结果可靠性的影响因素，比如，病毒感染剂量与疾病形成进程的控制等，而且可实现无法在病人中开展的，但又相当重要及更加具有侵入性（如微创手术等）的实验操作。

关于病毒与宿主相互作用研究的感染动物模型，虽然可选择的实验动物较多，也都具有各自的优势，然而，目前这方面的研究主要选择小鼠、大鼠、豚鼠、雪貂和非人灵长类动物（NHPs)。 在研究人病毒感染性疾病中，小鼠模型优势是非常明显的，比如，成本较低、容易繁殖饲养、繁殖较快和产仔数较多。更重要的是，近交系小鼠的遗传背景具有一致性，在此基础上，可对小鼠基因进行相应的编辑改造建立需要的模型，这都无疑有助于研究宿主特定基因在病毒致病过程中的影响作用，也有利于深入了解病毒或疫苗引起的宿主免疫系统反应及其免疫保护作用。

当然，小鼠模型也存在局限性。所以，将小鼠模型研究结果转化为人体时，需要谨慎小心。由于病毒感染人体或小鼠细胞，常常是通过与宿主体内特殊的细胞表面受体结合，与宿主的先天免疫反应等因素有关，而且，小鼠与人之间的存在一定的物种差异性，导致一些人病毒无法直接感染小鼠，或人病毒虽能在小鼠体内复制，但却难以引起感染疾病明显的症状表现。因此，利用各种类型的基因编辑小鼠、人源化小鼠、或者遗传多样性的小鼠品系等，从某种程度上可以克服野生型小鼠的短处，使小鼠模型成为研究宿主与病毒致病相互作用，评价疫苗与药物安全性及有效性的非常有用的研究工具。

二、应用小鼠模型研究人病毒感染性疾病有哪些主要策略与方法？

1. 病毒直接感染近交系小鼠模型

近交系小鼠的优势在于其实验操作结果的重复性好，利用C57BL/6或BALB/c 近交系小鼠遗传背景一致性的特点，降低了小鼠个体间遗传背景因素可能对病毒感染敏感性差别的影响，从而比较容易研究分析病毒致病及其复制的动态特征，比较不同病毒株毒力的差异。另外，过去25年以来，近交系C57BL/6小鼠也是基因编辑小鼠模型的常用品系，已被广泛应用于宿主特定基因在病毒感染应答中作用等方面的研究，为揭示特定基因在病毒感染性疾病或免疫应答中的特殊作用机制发挥了重要的作用。

2. 应用免疫缺陷小鼠模型建立人病毒易感的人源化小鼠模型

由于近交系小鼠对许多病毒不易感，即病毒在近交系小鼠体内不能或低复制，无法引起感染性疾病，比如HIV病毒、肝炎病毒、ZIKV病毒、人诺如病毒、出血热病毒等。小鼠模型对人病毒不易感，是因为小鼠体内没有适合人病毒感染的细胞结合受体。应用免疫缺陷小鼠建立人源化小鼠模型的目的，就是通过移植方法，将人细胞/组织导入免疫缺陷小鼠体内，使小鼠含有能与病毒特异结合的受体细胞（人免疫细胞系统）/组织，从而实现人病毒在小鼠体内的复制，并引起病毒感染疾病的发生。

该种人源化小鼠模型是在严重联合免疫缺陷小鼠的基础之上实现的，目前常用的免疫缺陷小鼠有：NOG（NOD/Shi-scid/IL2 rg null）、NSG（NOD/Scid/IL2 rg null)、NRG(NOD/Rag1null/IL2 rg null) 、BRG（BALB/c-Rag2 null/IL2rg null)和BRGS（BRG-SIRPa variant) 等。此种人源化小鼠模型在许多病毒致病机制（包括HIV、登革热、流感病毒等）中的研究发挥着重要作用。应用最多的是HIV方面的研究，比如，从该病毒复制、与免疫细胞相互作用，到评估控制与防治HIV感染发生的方法效果等。

除了移植人免疫细胞外，通过移植实体器官（比如肝），免疫缺陷小鼠被也应用于各种肝炎HBV、HCV、HDV和HEV病毒感染等方面的研究。这类研究有助于了解病毒引起肝损伤的病理机制，为评估慢性HCV和HBV感染疾病的潜在治疗对策提供了可能。

关于如何利用免疫缺陷小鼠，借助细胞/组织移植方式，构建人源化病毒感染小鼠模型，研究人相关疾病等方面的策略与技术方法，可参考我2018年中国实验动物信息网专访资料（https://www.lascn.net/Category_2182/Index.aspx）。

3. 应用基因编辑小鼠建立病毒感染性疾病小鼠模型

基因编辑技术的发展与进步，使研究者们通过基因修饰小鼠模型研究病毒感染性疾病成为可能。比如，将病毒感染人细胞相关的基因在小鼠体内表达/敲除/点突变，使原来对这些病毒不敏感的小鼠成为易感宿主，从而在小鼠体内研究病毒致病机制作用等。另外，在研究病毒关键蛋白是否参与其感染致病以及抗病毒免疫反应机制等方面，这类基因编辑小鼠模型也发挥了非常重要的作用。

关于基因编辑小鼠模型构建的基本策略与方法，可参考我在中国实验动物信息网中的相关专访资料（https://www.lascn.com/Category_2287/Index.aspx）。

A. 基因敲除病毒感染小鼠模型

针对人病毒感染相关特殊基因，构建基因敲除小鼠模型，将有助于揭示与评价在病毒感染致病过程中，体内参与先天和获得免疫反应的细胞分子特征。目前已有一些成功研制的病毒感染相关的基因敲除小鼠模型：1. 参与广泛免疫反应过程相关基因的敲除，比如，缺乏T细胞α(TCRA)/β（TCR-B） 的基因；缺乏B和T细胞成熟所需的重组激活基因1和2（RAG-1和RAG-2）；导致抗病毒反应受损的IFNs/IFNR的缺乏; 2. 免疫相关受体敲除小鼠模型, 比如，Toll样受体（TLRs）、维甲酸诱导基因I样受体（RLRs)和核苷酸结合寡聚结构域样受体（NLRs)等; 3. 相关转录因子敲除小鼠， 比如，信号转导和转录激活因子（STAT）和IFN调控因子（IRFs)等。

B. 转基因/基因敲入病毒感染小鼠模型

人病毒多是通过与人细胞表面等相关受体结合，进入细胞内并借助人细胞的帮助，才能开始复制增殖过程，从而导致人病毒感染性疾病的发生。因为物种间存在的差异，许多人病毒与小鼠细胞表面相应的受体很难直接结合，或者结合受体的亲和力不高。因此，借助基因编辑技术，将人细胞受体基因转入小鼠体内，构建遗传修饰人源化病毒感染小鼠模型，为在体内更好地开展人病毒致病性及抗病毒感染免疫反应机制等方面的研究，以及评价疫苗与药物的安全性和有效性等临床前相关研究提供了实际可行的工具。

4. 应用适应实验进化方式获得病毒变异强毒株

过去60多年来，应用适应实验进化策略，已成为研究人病毒感染性疾病的主要方法。应用该方法成功构建的病毒感染致死性小鼠模型，无疑有助于深入揭示病毒致病机制，评价疫苗与新疗法防治效果。

应用该方法建立病毒感染致死性小鼠模型，就是通过让病毒经过小鼠体内一系列的传代后，使其更加适应该宿主的先天与获得免疫反应，病毒在不断适应新宿主环境过程中，其本身遗传物质也会发生相应变化，病毒的毒性也可能随之而增强。所以，如同现实自然世界中病毒漫长的适应进化过程，病毒与宿主免疫反应之间的战斗是一直持续存在的，只不过这种所谓病毒小鼠适应实验进化策略，是人为地按加速时间与组织特异性的可控方式进行的。

5. 建立协同杂交（CC）遗传多样性重组小鼠品系

近交系小鼠以及在此基础上构建的遗传修饰小鼠模型由于其遗传背景一致性及结果可重复性等优点，成为研究病毒感染性疾病最为主要的实验动物模型。然而，应用遗传背景一致性小鼠也存在一定的局限性。不同于近交系小鼠，人群的遗传背景是高度异质化的，所以，由近交系小鼠获得的研究结果，无法真正揭示人群自然暴露于病毒所产生的表型多样性的特征。因此，如何增加小鼠品系的遗传背景多样性，以提高小鼠结果转化的可靠性，解决病毒感染与复杂遗传背景群体间相互作用问题，建立相应遗传背景多样性小鼠品系，比如协同杂交（Collaborative Cross-CC）小鼠品系，就具有一定的实际意义。

所谓CC小鼠品系，就是将一群不同遗传背景的小鼠品系，进行相互交配繁殖重组，使其与人群遗传多样性更加相似，从而有助于研究群体中，哪些宿主基因多态性决定表型变化。目前，CC小鼠品系是通过8种小鼠品系互配获得，其中包括5种经典实验室品系，比如C57BL/6J、 129S1/SvImJ、A/J、NOD/ShiLtJ和NZO/HiLtJ；以及其他3种野生品系，比如WSB/EiJ、CAST/ EiJ、和PWK/PhJ。应用“漏斗型育种”（funnel breeding ）的方式进行不断的繁殖交配，最终繁育形成的CC小鼠品系分别具有八种原始品系小鼠独一无二的基因组重组模式。目前已有超过60多种近交系CC小鼠品系可供研究者们使用(https:// csbio.unc.edu/CCstatus/index.py）。

目前提供的CC小鼠也为近交品系，因此，由这类小鼠产生的研究结果，同样具有重复性与可比性的优势。当然，考虑到CC小鼠是来自8种原始品系重组衍生而来的，也只是该8种小鼠遗传背景的独特组合，所以，来自CC小鼠研究的特殊表型结果，往往也不同于任何原始8种品系中单一小鼠品系的表型。利用CC小鼠表型多样化的优势，有助于建立病毒感染性疾病的完善模型。比如，对于Ebola病毒感染小鼠模型，虽然，应用小鼠适应Ebola病毒可以感染常规野生小鼠品系，研究疾病致病过程和验证疫苗与治疗效果，但是，这类感染小鼠模型无法完全反映该病毒感染人体所表现出的临床疾病特征。应用CC小鼠构建新型Ebola病毒感染性出血热疾病小鼠模型，通过分析出现包括出血现象和肝损害等严重疾病症状的CC小鼠品系表明，不同的CC小鼠表现出差异极大的易感性。

通过比较来自CC小鼠品系的表型结果，有利于揭示宿主遗传背景变化对特定表型的影响，包括病毒感染引起的免疫应答反应，以及特定遗传位点的特殊作用等。已有的研究结果表明，利用CC小鼠所具有的遗传多样性优势，建立不同的新型小鼠模型，使病毒感染与疾病关系的研究更接近人群病毒感染疾病表型。并且，如果一旦建立了某个新型病毒感染疾病表型的CC小鼠，进一步识别与该新型病毒感染疾病表型结果相关的遗传位点就成为可能，从而有助于充分揭示该病毒的致病机制。因此认为，CC小鼠是目前能更好反映人疾病某些特性，并应用于病毒感染性疾病研究的新型小鼠模型。

三、应用小鼠模型研究病毒感染性疾病的前景与展望？

应用遗传背景明确的近交系小鼠、细胞/组织移植的人源化小鼠、以及基因编辑小鼠等模型不仅有助于研究病毒致病机制、阐明特异性基因在感染性疾病发展中作用，也为针对不同病毒感染疾病预防与治疗的潜在靶点的寻找，提供了有效且方便可行的体内研究实验动物。

我们需要明白的是，没有哪种实验动物模型能完全复制人病毒感染的真实反应过程，只能选择较为合适的动物模型，这需要考虑多方面的综合因素，比如，是否对该病毒敏感、与人体生理学方面的保守性、重复性、简便可行的操作、安全与成本等方面。

理想的人病毒感染疾病动物模型， 应该是能真实反映人病毒感染性疾病的临床症状和致病过程。当然，最佳动物模型还应该符合其他要求，比如，动物对人病毒易感，有与人病毒感染性疾病相似的感染途径。另外，按FDA的“动物有效规则”，出于安全与伦理考虑，无法直接在人群进行疫苗与治疗方面等的实验研究。因此，人群研究必须是在通过了应用相应动物模型的临床前实验研究之后，才能获得批准的。病毒学的许多研究领域，都需要应用符合要求的标准化动物模型来评价疫苗与治疗方法的安全性与有效性。比如，基因敲除小鼠、转基因小鼠、人源化小鼠等。

病毒易变异的特性，增加了建立理想的动物模型的难度。所以，为了能更加准确反映病毒自然感染变化特征，建立所谓理想动物模型的策略与方法也需要随之而发展。

在研究人病毒感染性疾病特征及其免疫反应机制等方面，应用细胞/组织移植方法建立的人源化小鼠模型已成为极其重要的研究工具。当然，该类人源化小鼠模型也存在一定的局限，比如：1. 在构建过程中，小鼠与小鼠种系之间常常出现差异变化，增加了准确解释结果的难度；2. 该方法构建的小鼠-人嵌合模型中，相关分子和细胞在小鼠体内发育与形成并非是完整的，导致某些细胞间的相互作用难以顺利进行；3. 在这种人源化小鼠中，调控病毒致病过程的机制也可能与真实情况有所不同。比如，B细胞的成熟、抗体产生和凝血反应等表现出不同的调控机制；4. 与其他小鼠模型相比，则有构建成本较高，动物操作与相关供应方面限制等不足。

因此，应用基因编辑技术构建人源化小鼠模型就显示其独特的优势。在传统原核注射转基因和ES打靶技术基础上，CRISPR-Cas基因编辑创新技术的出现，结合Cre/lox系统的应用，使对相关基因进行时间与空间上特异性的修饰成为可能，从而极大促进了小鼠模型在研究病毒感染性疾病中的应用。小鼠基因组学及其完整的遗传信息方面研究的不断发展，为研发新型小鼠模型创造了条件。

小鼠模型已经是，并且将继续是研究病毒感染性疾病致病机制，以及评价疫苗和抗病毒疗法的重要资源。虽然，小鼠模型并不适合某些病毒引起的相关疾病，比如某些人病毒只感染人或黑猩猩 ，但借助基因编辑技术与人源化小鼠模型，则可能有助于此类病毒感染性疾病小鼠模型的建立。并且遗传背景多样性的CC小鼠品系的获得，也使研究宿主遗传多样性对感染反应性的影响成为可能。利用CC小鼠品系的表型多样性的特点，也将有助于构建相应的能更好反映人病毒感染性疾病特性的实验模型体系。

关于赛业

赛业生物历经14年发展，已服务全球数万名科学家，产品和技术已直接应用于包括CNS（Cell，Nature, Science）三大期刊在内的3500余篇学术论文。除了提供基因敲除、基因敲入、条件性基因敲除模型定制服务外，赛业生物还有专业的手术疾病模型团队，可以提供多种复杂精细的小动物手术疾病模型；国际标准化无菌鼠技术平台可以提供无菌鼠、无菌动物定制服务、微生物菌群移植服务等基于无菌动物模型的各类产品和服务，结合赛业生物成熟稳定的基因编辑小鼠平台，还可帮助您研究菌群与基因的互作机制。如有需要，欢迎后台留言或者联系我们咨询。