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海军军医大学揭示半胱氨酸泛素化可调控抗病毒免疫反应

泛素化是最普遍的蛋白质翻译后修饰之一。泛素通常与底物蛋白上的赖氨酸残基连接,但也可以结合非赖氨酸残基。以往的研究证明,赖氨酸残基的泛素化在多个细胞和生物学过程中起着重要作用,但非赖氨酸残基作为泛素化位点有何生理学意义,目前还知之甚少。

 

近日,海军军医大学安华章教授和袁红斌教授领导的研究团队在Nature Communications杂志上发表了题为“E3 ligase Nedd4l promotes antiviral innate immunity by catalyzing K29-linked cysteine ubiquitination of TRAF3”的论文,揭示了E3连接酶Nedd4l通过催化TRAF3中的K29连接的半胱氨酸泛素化来正向调控抗病毒免疫反应。

E3连接酶Nedd4l通过催化TRAF3中的K29连接的半胱氨酸泛素化来正向调控抗病毒免疫反应

 

Nedd4l调控了抗病毒先天免疫

Nedd4l(又称Nedd4-2)是泛素连接酶Nedd4家族中的一员,属于HECT型E3泛素连接酶。它最为人熟知的功能是对上皮细胞的钠通道进行调控。在TGF-β信号通路中,Nedd4l下调了TGFβR1和Smad2以限制TGF-β信号传导。

 

为了研究Nedd4l是否在抗病毒先天免疫中起作用,研究人员使用了自发突变的Nedd4l缺陷型小鼠模型。他们从小鼠中分离出原代腹膜巨噬细胞,然后利用水疱性口炎病毒(VSV)感染。通过ELISA分析和RT-qPCR分析,他们发现,Nedd4l的缺乏会破坏病毒诱导IFN-β、IL-6和TNF-α的产生。

 

接下来,他们通过Nedd4l条件性基因敲除小鼠(由赛业生物提供)体内实验发现,骨髓中Nedd4l的缺乏并不影响主要免疫细胞群的发育。不过,Nedd4l的条件性缺失抑制了VSV诱导体内IFN-β和IL-6的产生。与对照小鼠相比,基因敲除小鼠脾脏和肝脏中的VSV复制和病毒滴度(TCID50)升高,存活率大大降低(图1)。这些结果表明,Nedd4l正向调控了巨噬细胞中I型干扰素和促炎性细胞因子的产生,对于体内抗病毒先天免疫至关重要。

图1. Nedd4l的条件性缺失抑制了体内的抗病毒先天免疫

图1. Nedd4l的条件性缺失抑制了体内的抗病毒先天免疫。

 

Nedd4l直接与TRAF3相互作用

在感染VSV后,RIG-1样受体(RLR)会激活IRF3、NF-κB和MAPK,诱导I型干扰素和促炎性细胞因子的产生。研究人员此次发现,Nedd4l的缺乏会抑制VSV诱导的IRF3磷酸化。通过进一步分析IRF3的上游分子,他们发现Nedd4l的缺乏减少了TRAF3/TBK1复合物的形成,而Nedd4l的过表达则增加了TRAF3与TBK1的结合。

 

为了阐明这背后的机制,他们研究了Nedd4l是否与MAVS、TRAF3或TBK1相互作用。通过免疫共沉淀等实验,他们发现在这三个分子中,只有TRAF3与Nedd4l发生相互作用。GST pull-down实验也证明了两者之间的直接相互作用(图2)。他们还进一步证明,Nedd4l通过其WW结构域与TRAF3结合。

图2. Nedd4l与TRAF3发生相互作用

图2. Nedd4l与TRAF3发生相互作用。

 

Nedd4l对TRAF3的半胱氨酸残基进行泛素化

TRAF3的泛素化是病毒诱导TRAF3/TBK1复合物形成所必需的。由于Nedd4l与TRAF3存在相互作用,研究人员推测Nedd4l通过促进TRAF3的泛素化而增加TRAF3/TBK1复合物的形成。实验证实,Nedd4l的缺乏降低了巨噬细胞中VSV感染诱导的TRAF3泛素化。之后,他们利用一系列带有HA标记的Ub突变体(K11R、K29R、K33R、K48R、K63R)来鉴定多聚泛素链形成所需的赖氨酸残基。结果表明,仅K29突变破坏了Nedd4l介导的TRAF3泛素化,也就是说,Nedd4l直接催化了K29连接的TRAF3泛素化。

 

接下来,他们试图在TRAF3中鉴定Nedd4l催化的泛素化位点。通过LC-MS/MS分析,他们意外发现在Nedd4l过表达的细胞中,两个半胱氨酸残基C56和C124的泛素化也增加了,这两个残基参与构成了TRAF3中的RZ1和Z1锌指。C56和C124的突变显著降低了Nedd4l催化的K29连接的泛素化,表明C56和C124残基是Nedd4l催化的泛素链所连接的泛素化位点(图3)。后续的分析表明,RZ1和Z1锌指的调节或破坏会增加TRAF3泛素化。

图3. Nedd4l对TRAF3中的半胱氨酸残基进行泛素化

图3. Nedd4l对TRAF3中的半胱氨酸残基进行泛素化。

 

此外,TRAF3也被其他E3连接酶泛素化,比如cIAP1/2和HECTD3。于是研究人员又分析了Nedd4l是否影响TRAF3与其他E3连接酶之间的相互作用。他们发现,Nedd4l缺乏降低了TRAF3与cIAP1/2和HECTD3的相互作用,而过表达则促进了它们之间的相互作用。C56和C124突变则更有效地招募了TBK1以形成TRAF3/TBK1复合物,并增加了VSV诱导的IFN-β、IL-6和TNF-α 的mRNA表达,证明了半胱氨酸残基在调控病毒诱导的先天免疫中很重要。

 

这项研究表明,Nedd4l通过催化TRAF3中K29连接的半胱氨酸残基的泛素化来促进VSV和LPS诱导的I型干扰素产生。作者认为,这不仅表明Nedd4l是抗病毒先天免疫的关键调控因子,也表明TRAF3泛素化的调控环境比以前预期的要复杂得多。同时,这项研究也显示了半胱氨酸泛素化在先天免疫中的重要性。

 

原文检索:

Gao, P., Ma, X., Yuan, M. et al. E3 ligase Nedd4l promotes antiviral innate immunity by catalyzing K29-linked cysteine ubiquitination of TRAF3. Nat Commun 12, 1194 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-21456-1.

 

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