湘雅医院张卫社教授、戴镭博士后团队在国际上首次发现人类双肾缺如新致病基因

近日，中南大学湘雅医院产科张卫社教授、戴镭博士后领导的产前诊断研究团队在美国肾病学学会官方期刊《Journal of the American Society of Nephrology》上发表了题为“A Biallelic Frameshift Mutation in Nephronectin Causes Bilateral Renal Agenesis in Humans”的文章，影响因子10.12，为国际上首次发现肾连蛋白（NPNT）基因是导致人类双肾缺如的致病基因。戴镭博士后为论文独立第一作者，张卫社教授为论文独立通讯作者。

先天性肾尿路畸形是一种常见的出生缺陷，新生儿的发病率约为2/1000，在所有儿童先天性畸形中占30-40%。双肾缺如（BRA）则是先天性肾尿路畸形中最严重的类型，通常会导致围产期死亡或终止妊娠。尽管人们认为遗传因素扮演了重要角色，但仍有大部分病例的确切原因得不到诊断。

全外显子组测序发现NPNT突变

在该研究中，一对近亲夫妻连续三次妊娠都显示双肾未显示、羊水过少，怀疑胎儿患有双肾缺如而不得不引产，并通过引产胎儿的病理解剖得到证实。为了确定这背后的遗传因素，研究人员对这个家庭中的多名成员开展全外显子组测序（WES）（图1）。

图1. NPNT突变的家族谱系图

研究人员发现在两个异常胎儿共享了35.05 Mb的基因组区域，并从那些共有的连续性纯合片段（ROH）中发现了310个变异。在去除了InterVar预测为良性和可能良性的变异后，剩下NPNT基因第8个外显子中的纯合移码突变（c.777dup/p.Lys260*）。因此研究人员认为，NPNT可能是导致双肾缺如的第一候选基因。

肾连蛋白（Nephronectin，NPNT）对肾脏发育至关重要，小鼠中Npnt的敲除往往会导致肾缺如或发育不全。因此，NPNT被认为是双肾缺如的可能致病基因，但以往的研究NPNT突变并未在肾发育不全患者中报道。研究人员通过软件预测，移码突变可能导致下一个密码子形成终止密码子，从而产生截短蛋白，只有260个氨基酸。该预测通过体外过表达实验得到了证实。

在过表达WT-NPNT和K260ter-NPNT的HEK293T细胞中，研究人员发现K260ter-NPNT mRNA表达水平显著低于野生型对照。使用Flag标签抗体的Western blot分析在K260ter-NPNT转染细胞中检测到35 Kda的截短蛋白，且表达量降低，而针对突变下游表位的NPNT抗体则没有检测到截短蛋白，与预期一致（图2）。这些结果证实，p.Lys260* 突变导致无义介导的mRNA降解和截短蛋白的产生。

图2. WT-NPNT和K260ter-NPNT在293T细胞中的过表达

Npnt突变小鼠显示肾发育不全

研究人员委托赛业生物，构建了带有Npnt-c.777dup/p.Lys260*突变的基因敲入小鼠，并通过杂合小鼠的交配产生纯合突变体（Npnt^K260*/K260*）。利用Npnt抗体对纯合小鼠的肺组织开展WB分析，未检测到任何NPNT蛋白（图3），表明引入小鼠模型的突变影响了Npnt蛋白的表达，与人类相似。

图3. 模拟纯合移码突变的基因敲入小鼠的构建

所有小鼠出生时都有着正常的外观（大小、体重且无外部缺陷），但纯合小鼠在出生后第二天死亡。研究人员解剖后发现，绝大多数纯合小鼠的两侧都没有肾脏（14/15），伴随着输尿管的缺失；剩下的一只Npnt^K260*/K260*小鼠有两个尺寸较小的原始肾脏。组织学分析显示，纯合原始肾脏中的肾单位发育停滞，而其他组织没有明显的形态异常。

有意思的是，Npnt^K260*/K260*小鼠与Npnt−/−小鼠的表型存在一些差异。Npnt^K260*/K260*小鼠的双肾缺如频率高达93.3%，而以往报告的Npnt^−/−小鼠频率为46%。作者认为，可能的原因在于另一种配体在功能上补偿了Npnt^−/−小鼠缺失的Npnt蛋白。在Npnt^K260*/K260*小鼠中，截短的Npnt蛋白残基可能对替代配体产生负面影响。另一种可能的解释是遗传背景不同，近交系小鼠表现出较低的性状可变性。

总结

这项研究表明，该患病家庭中出现的双等位基因功能缺失NPNT突变是造成人类双肾缺如的原因。模拟该突变的小鼠模型再现了双肾缺如的临床表型。这些结果揭示了双肾缺如的新致病基因，为双肾缺如家族的遗传诊断、产前诊断和胚胎植入前诊断提供了新的靶点。

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原文检索：

Lei Dai, Jingzhi Li, Liangqun Xie, et al. A Biallelic Frameshift Mutation in Nephronectin Causes Bilateral Renal Agenesis in Humans. JASN August 2021, 32 (8) 1871-1879; DOI: https://doi.org/10.1681/ASN.2020121762

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