西安交通大学邵永平/刘培军/温玉荣团队合作揭示失巢凋亡中Bmf活性调控新机制

失巢凋亡是由于细胞脱离细胞外基质而启动的特殊的程序性细胞凋亡，在机体发育、组织自身平衡、疾病发生和肿瘤转移等方面起重要作用。BH3-only促凋亡蛋白Bmf是失巢凋亡的重要介质。当细胞失去与细胞外基质的附着时，系留在细胞骨架上的Bmf与动力蛋白轻链2（DLC2）发生解离，易位到线粒体，从而促进失巢凋亡的发生。然而，关于Bmf在细胞骨架上的系留及解离这一关键过程的调控机制仍然未知。

近日，西安交通大学邵永平/刘培军/温玉荣团队合作在Cell Death & Differentiation期刊上发表了题为“Non-canonical phosphorylation of Bmf by p38 MAPK promotes its apoptotic activity in anoikis”的研究论文，揭示了失巢凋亡中Bmf活性调控新机制，并为Bmf蛋白细胞骨架的系留与解离过程提供了结构基础。

研究人员发现，当乳腺上皮细胞MCF-7和MCF10A脱离细胞外基质、细胞凋亡信号上升时，p38 MAPK激酶呈现为迅速且持续活化状态。而抑制p38信号通路或Bmf的选择性敲除对失巢凋亡有挽救效果。因而该研究从乳腺上皮细胞失巢凋亡入手，基于MAPK信号通路在压力应激诱导的细胞凋亡中的重要作用，探究失巢凋亡过程中上游p38激酶对Bmf促凋亡活性的可能调控机制。

p38激酶介导的Bmf T72磷酸化阻断Bmf/DLC2相互作用

由于p38激酶和Bmf都参与了失巢凋亡的调节，研究人员推测激活的p38可能通过磷酸化调节Bmf的凋亡活性来调节失巢凋亡。初始研究表明Bmf在从细胞骨架上解离后发生多位点磷酸化修饰。根据生物信息学预测以及与同家族蛋白Bim的已知磷酸化位点对比分析发现T72，S74与S77位点可能为Bmf蛋白的磷酸化位点。通过表达纯化野生型及这些位点突变的Bmf蛋白，结合p38体外激酶实验，研究人员验证了这三个位点可直接被p38激酶磷酸化。由于p38磷酸化位点( T72、S74和S77 )均位于Bmf的DLC2结合域内或附近，研究人员研究了Bmf磷酸化对其与DLC2结合的影响(图1 )。结果发现T72磷酸化可以破坏Bmf / DLC2相互作用，而S74和S77磷酸化对此没有影响。此外，研究还发现Bmf T72的磷酸化可导致Bmf从细胞骨架的肌球蛋白V复合物中解离并易位到线粒体。

图1. A：Bmf蛋白的DLC2结合域示意图；B-F：纯化的 6xHis-DLC2 蛋白与磷酸化Bmf多肽的结合测定。

Bmf/DLC2相互作用的结构基础

为了解T72磷酸化对Bmf/DLC2相互作用影响的分子机制，研究人员以2.0μA的分辨率解析Bmf/DLC2复合物的晶体结构(图2)。根据DLC2 / Bmf复合物结构，Bmf残基T72利用其主链和侧链与DLC2的F62形成两个极性互作，增强复合物的稳定性。为了进一步证实T72在DLC2/Bmf相互作用中的重要作用，研究人员发现T72A突变完全抑制了DLC2与Bmf的结合，而S74A/S77A双突变Bmf保持了接近WT水平的DLC2结合能力。这些结果表明T72残基（而非S74或S77）参与了Bmf与DLC2的结合，而磷酸化T72很可能通过空间位阻破坏Bmf/DLC2的相互作用。

图2. Bmf/DLC2和Bim/DLC1复合物的结构比较。

T72的拟磷突变增强了Bmf体外和体内的凋亡活性

为了研究Bmf磷酸化对其凋亡活性的影响，研究人员构建了可诱导表达WT或拟磷突变Bmf的MCF-10A和MCF-7细胞系，发现诱导表达T72拟磷突变Bmf相较于WT Bmf可显著增强人乳腺上皮细胞的凋亡水平（图3）。

图3. T72的拟磷突变增强了Bmf体外凋亡活性。

接下来，为了检测这种拟磷突变的体内活性，研究人员委托赛业生物构建了BmfT158E (相当于人体内的BmfT72E )敲入小鼠模型，Bmf^{T158E / T158E}小鼠未见明显发育缺陷，但淋巴细胞稳态遭破坏，脾脏T，B淋巴细胞总数减少，小鼠脾脏重量减轻。此外，Bmf^T158E/T158E小鼠乳腺上皮细胞凋亡率明显高于WT小鼠，乳腺导管内径变粗。上述结果说明T158E突变提高了Bmf的体内促凋亡活性（图4）。

图4. T72 的拟磷突变增强了Bmf体内凋亡活性。

总结

该研究从结构层面解析Bmf/DLC2互作关系，并利用细胞系模型和Bmf^T158E knock-in小鼠模型研究磷酸化修饰对Bmf凋亡活性的活化机制，揭示了失巢凋亡中Bmf促凋亡活性调控的一种新机制，并为Bmf细胞骨架的系留与解离过程提供了的结构基础。

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原文检索：

Zhi Z, Ouyang Z, Ren Y, Cheng Y, Liu P, Wen Y, Shao Y. Non-canonical phosphorylation of Bmf by p38 MAPK promotes its apoptotic activity in anoikis. Cell Death Differ. 2021 Aug 30. doi: 10.1038/s41418-021-00855-3. Epub ahead of print. PMID: 34462553.

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