怎样才能让免疫药物更好用？CTLA-4/OX40双特异性抗体ATOR-1015的临床前数据详解

背景

CTLA-4抗体无论是单独用药还是与PD-1抗体的联合用药，都展示出了良好的应用前景。例如，由美国百时美施贵宝（Bristol Myers Squibb，BMS）开发的Ipilimumab（商品名Yervoy），其已获FDA批准用于结直肠癌、肝细胞癌、恶性胸膜间皮瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌的治疗（单独用药或与Nivolumab联合用药）^[2]。然而，CTLA-4抗体的免疫相关不良事件（immune-relatedadverse events，irAEs），例如胃肠道毒性、皮肤毒性和肝脏毒性等，一直是个令人头疼的问题。这个问题有希望通过使用双抗来解决。之前我们讲过由AstraZeneca公司研发的一款PD-1/CTLA-4双抗MEDI5752，这次我们来看看Alligator Bioscience公司的CTLA-4/OX40双抗ATOR-1015表现如何。

ATOR-1015的构建

CTLA-4与OX-40都在活化T细胞，特别是肿瘤微环境中的Treg细胞上高表达。因此与单抗相比，同时靶向这两种免疫检查点的双抗理论上能更精准的定位于肿瘤区域，这将有助于降低T细胞的系统性激活，并提高疗效。此外，已有研究显示，联用CTLA-4抑制型抗体与OX40激动型抗体能显著增强T细胞的扩增和效应功能，具有强效的抗肿瘤作用^[3]。ATOR-1015是一种同时靶向人CTLA-4和OX40的IgG1双抗。其OX40结合部分是从ALLIGATOR-GOLD^®人类scFv文库分选出来的。而其CTLA-4结合部分则是提高了稳定性和亲和性的人CD86的Ig样V型结构域（图1A）。

ATOR-1015能与靶蛋白结合并阻断其与其配体的结合

通过检测ATOR-1015与过表达靶蛋白的CHO细胞的结合以及ELISA实验等，研究者们发现ATOR-1015能以高亲和力与CTLA-4结合并阻断其与CD80和CD86的相互作用（图1B-C）; 同时，它也能与OX40上的结构域2结合并抑制其与OX40L的相互作用（图1D-E）。

图1. ATOR-1015能与CTLA-4和OX40结合并阻断其与其天然配体的结合^[1]。

ATOR-1015可以将表达CTLA-4的细胞与表达OX40的细胞进行交联

研究者们分别使用PKH26和PKH67对表达CTLA-4的HEK细胞和表达OX40的CHO细胞进行染色，将它们混合均匀后与ATOR-1015、αCTLA-4抗体和αOX40抗体，或者IgG1对照抗体共培养。结果显示，只有在使用ATOR-1015处理的样品中，存在剂量依赖性增加的PKH26和PKH67双阳性的细胞复合物（图2A），这表明ATOR-1015可以将表达CTLA-4的细胞与表达OX40的细胞进行交联。

ATOR-1015可以激活T细胞

为了探究ATOR-1015对T细胞的激活作用，研究者们设计了一个荧光素酶报告基因实验。他们构建了两款细胞：一款表达CTLA-4和荧光素酶的Jurkat细胞，其荧光素酶报告基因由IL-2启动子调控，而IL-2启动子能响应TCR/CD28激活信号；另一款则是表达CD80/CD86和可激活TCR的人工T细胞激活剂的Raji细胞。当这两种细胞共培养时，CD80/CD86能与CTLA-4以相较CD28更高的亲和力结合，从而阻断T细胞的激活，导致无IL-2的产生，无荧光信号。而当加入ATOR-1015后，ATOR-1015与CTLA-4结合，并阻断了其与其配体的结合，因此CD80/CD86转而与CD28结合，激活T细胞产生IL-2，荧光素酶表达，产生荧光信号（图2B）。此外，研究者们也探究了ATOR-1015对人原代T细胞的激活作用。实验结果显示，当与CTLA-4（图2C-D）或FcγRI（图2E）交联时，ATOR-1015都可以通过OX40诱导T细胞活化。

图2. ATOR-1015可使细胞聚集并诱导T细胞活化^[1]。

ATOR-1015可以诱导Tregs的清除

研究者们通过ADCC报告基因实验间接测量了ATOR-1015诱导ADCC的能力。结果显示，在表达CTLA-4和OX40的CHO细胞中，与αCTLA-4和αOX40单抗联合给药或单独给药相比，加入ATOR-1015能显著激活FcγRIIIa的表达（图3A-B）。此外，流式实验显示，人原代Tregs的活化会导致CTLA-4和OX40表达的上调，其中后者的上调更为显著（图3C-D）。

当将活化Tregs与FcγRIIIa共培养时，加入ATOR-1015后能检测到FcγRIIIa表达量的显著提升（图3E）；当将活化Tregs与原代NK细胞共培养时，可观察到ATOR-1015与αCTLA-4 和αOX40单抗联用对Tregs的剂量依赖性裂解（图3F）。

图3. ATOR-1015可诱导FcγR信号传导，并清除表达靶蛋白的细胞^[1]。

ATOR-1015可诱导抗肿瘤反应和长期免疫记忆

尽管ATOR-1015的CTLA-4结合域与小鼠的CTLA-4结合域（mCTLA-4）有强烈的交叉反应，但其OX40结合域与mOX40无交叉反应，因此研究者们使用了hOX40小鼠。该小鼠的OX40蛋白胞外域序列被替换成人源序列，保留小鼠跨膜域和胞内域序列，并由小鼠内源性启动子驱动。研究者们在该小鼠中移植MB49小鼠膀胱癌细胞，构建同源肿瘤模型（syngeneic tumor models）。体内实验结果显示，ATOR-1015可显著抑制肿瘤生长并提高hOX40小鼠存活率（图4A-D），且能诱导至少5个月以上的肿瘤特异性的长期免疫记忆（图4E-F）。

图4. ATOR-1015可诱导抗肿瘤反应和免疫记忆^[1]。

ATOR-1015可定位于肿瘤，增加肿瘤中CD8⁺ T/Treg细胞的比例

抗肿瘤效应同样也在hOX40小鼠的MC38同源肿瘤模型中得到了验证。体内实验结果显示，ATOR-1015可显著抑制肿瘤生长并提高小鼠存活率（图5A-C）。为了探究ATOR-1015对肿瘤浸润性T细胞的选择性结合力，研究者们收集了抗体处理24h后hOX40小鼠的MC38同源肿瘤模型的肿瘤和脾脏组织，检测了其中与抗体结合的细胞比例（表现为hIgG⁺细胞占total live CD45⁺细胞的百分比）。结果显示，与溶剂、IgG1对照组和αCTLA-4相比，ATOR-1015和αOX40单抗能选择性结合肿瘤浸润性T细胞（图5D-E）。

图5. ATOR-1015可定位于肿瘤，并诱导抗肿瘤反应^[1]。

为了进一步探究ATOR-1015的肿瘤定位能力，研究者们对Tregs和CD8⁺ T细胞的数目和激活状态进行了检测。结果显示，在hOX40小鼠的MC38同源肿瘤模型中，与单抗单独给药相比，ATOR-101处理24能显著增加肿瘤中CD8⁺ T/Treg细胞的比例，但在脾脏中则无该现象（图6A-B）。该比例的上升主要是由于肿瘤中Tregs比例的下降（图6C）和CD8⁺ T细胞比例的上升（图6D）。此外，ATOR-101处理后，CD8⁺ T细胞上CD107a和颗粒酶B的表达量显著上升，说明它们具有细胞毒性表型（图6E-F）。

图6. ATOR-1015可清除肿瘤中的Tregs并激活Teffs^[1]。

ATOR-1015可增强αPD-1抗体的治疗效果

为了探究ATOR-1015对αPD-1抗体疗效的增强作用，研究者们再次使用了同源肿瘤模型。实验结果显示，在荷瘤（MB49）杂合子hOX40小鼠中，使用ATOR-1015或αPD-1单抗单独给药可以诱导强烈的抗肿瘤反应；而两者联合给药能在所有荷瘤小鼠中观测到完全缓解（图7）。

图7. ATOR-1015可增强αPD-1抗体的治疗效果^[1]。

小结

在基于hOX40小鼠构建的同源肿瘤模型中，通过同时靶向CTLA-4和OX40，ATOR-1015能高效定位于肿瘤部位，通过降低免疫抑制性Treg的比例、提高CD8⁺ T细胞数目并激活其细胞毒性效应，发挥抗肿瘤作用。目前，ATOR-1015已完成针对晚期和/或难治性实体恶性肿瘤患者的临床1期首次人体试验（NCT03782467）。然而，I期试验数据表明ATOR-1015存在输液相关不良反应，而这可能与抗药抗体（anti-drug antibodies）的产生有关，需要对临床数据进行彻底评估^[4]。