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rAAV病毒质检QC知识知多点

rAAV病毒QC知识

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是一类单链线性DNA缺陷型病毒。通过对AAV进行工程化改造,科学家已经制造出了适合用于细胞转染的重组AAV载体(rAAV,即recombinant AAV)。它们具有免疫原性低、靶向性强、宿主范围广和可长期稳定地表达外源基因等特点,因此被科研人员广泛应用于基因功能研究的体内基因操作实验。近年来备受关注的基因治疗领域,它最重要的递送载体是rAAV。rAAV的生产与制备是基因治疗中的一个重要环节和难点,这是因为rAAV的包装体系和纯化方法等条件均会影响侵染效率和目的基因的表达效率,最终影响使用的效果。因此,对rAAV进行质检是一个重要的环节。下面给大家介绍rAAV包装生产后的必要质检项目。

 

一、rAAV的生产体系

rAAV的包装生产一般使用三质粒共转染系统,可大致分为以下四个步骤:目的序列制备并克隆至载体、病毒包装、收毒与纯化浓缩、质检。

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                                                                   图 1 rAAV生产流程

 

二、rAAV的质检

rAAV的质量对后续的体内实验有着重要的影响,这包括判别rAAV是否具备生物活性和rAAV用量等。因此需要对每批新产的rAAV进行质检。质检通常包括滴度检测、衣壳蛋白纯度检测、基因组大小及纯度检测和生物学活性检测等。

 

1滴度检测

 

滴度检测指检测rAAV的基因拷贝数,计算每ml病毒液的病毒颗粒中含有的基因组拷贝总数。具有多种检测的手段,包括DNA斑点杂交(dot-blotting)、ELISA、qPCR和ddPCR等,通常使用绝对定量的方法。首先通过建立标准曲线,得知标准品DNA含量与CT值的线性关系。在此基础上,检测出rAAV病毒的CT值,便可以得到病毒的滴度。

 

2病毒基因组大小及纯度检测

 

rAAV基因组鉴定较为简单,只需要提取rAAV的基因组,再进行琼脂凝胶电泳即可。由于我们已经知道目的序列和两端ITR的整个rAAV基因组大小,所以从电泳结果便可以判别出rAAV是否包含我们目的的片段,此外还能得知是否存在不正确的核酸序列或杂质。

 

以赛业生物的数据为例,我们包装了多个含有不同目的序列的rAAV2和rAAV8。提取rAAV病毒基因组后,经琼脂糖凝胶电泳检测,可以看到各种组合的基因组大小均符合预期,并且无其他杂带,这样便能说明rAAV基因组大小及纯度是合格的。

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图 2 病毒基因组大小及纯度检测

 

(数据来源:赛业生物)

Line1:rAAV2-CMV-EGFP (20220217)1E+10 (ITR滴度)2623bp

Line2:rAAV8-CMV-luc(C+S)(20220225) 1E+10(ITR滴度)3464bp

Line3:rAAV8-CMV-EGFP(C+S)(20220225) 1E+10(ITR滴度)2623p

Line4:rAAV2-IRES-hrGFP(20210907)1E+10(ITR滴度)3544bp

Line5:rAAV2-CMV-EGFP(20220217)2E+10(ITR滴度)2623bp

Line6:rAAV8-CMV-luc(C+S) (20220225) 2E+10(ITR滴度)3464bp

Line7:rAAV8-CMV-EGFP(C+S)(20220225)2E+10(ITR滴度)2623bp

Line8:rAAV2-IRES-hrGFP(20210907) 2E+10(ITR滴度)3544bp

 

3rAAV衣壳蛋白检测

 

由于rAAV衣壳蛋白决定了rAAV的感染效力,所以在检测rAAV基因组过后还需检测衣壳蛋白纯度。推荐使用商业化蛋白提取试剂盒,用于提取rAAV的衣壳蛋白,然后再通过SDS-PAGE 考染/银染检测方法,检测rAAV衣壳蛋白的纯度。优质rAAV的衣壳VP1、VP2、VP3的分子量大小分别为87KD、72KD、62KD,且数量比约为1:1:10。

 

以赛业生物的数据为例,我们包装了多个含有不同目的序列的rAAV8和rAAV9。在提取不同组合的rAAV衣壳蛋白后,分别进行考染和银染。从结果可以看出,不同组合的rAAV衣壳蛋白大小均符合预期,并且VP1、VP2、VP3的条带亮度也符合1:1:10。此外也不存在杂带,所以这个结果是可以说明包装出的rAAV衣壳蛋白纯度较高,间接说明各组rAAV应具备较高的感染活性。

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图 3 病毒衣壳蛋白纯度检测

(数据来源:赛业生物)

 

SDS-PAGE考染:Lane1:rAAV9-CMV-EGFP,3E11vg;Lane2:rAAV9-CMV-Luc,3E11vg;Lane3:rAAV8-CMV-EGFP,3E11vg;Lane4:rAAV8-CMV-Luc,3E11vg;Lane5:rAAV9-CMV-EGFP,1.5E11vg。

SDS-PAGE银染:Lane1:rAAV2-IRES-hrGFP,9E10vg;Lane2:rAAV2-IRES-hrGFP,4.5E10vg;Lane3:rAAV2-IRES-hrGFP,1.5E10vg。

 

4生物学活性检测

生物学活性检测是指使用rAAV感染293T等细胞,检测rAAV的侵染效率。常用的检测手段是在rAAV中包装一个荧光蛋白,在转染293T细胞后,通过荧光亮度直观地指示rAAV的侵染效率。此外,还能通过流式检测获得更为严谨的数据。

 

以赛业生物的数据为例,我们用不同类型不同浓度的rAAV感染293T细胞,通过观察荧光和流式检测,鉴定rAAV的感染效率。在荧光强度观察中,rAAV2、rAAV8、rAAV9以MOI=1E5侵染293T细胞,48h后能观察到强烈的荧光信号。

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图 4 rAAV感染293T细胞后48h荧光观察(数据来源:赛业生物)

 

在流式检测中,rAAV2、rAAV8、rAAV9分别以MOI=1E5、1E4、1E3、1E2侵染293T细胞。组合rAAV2-MOI=1E5的GFP阳性率达到99.66%,并且其他的组合也有较高的GFP阳性率。说明包装出的rAAV具有很强的侵染能力。

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图 5 rAAV感染293T细胞流式检测

(数据来源:赛业生物)

 

三、小结

rAAV的质量对于后续的使用有着重要的影响,为了确保后续实验可以顺利进行,那么在rAAV生产质检这一环节就需要严格把关,以多种指控标准进行检测,务求生产出优质的rAAV。

 

赛业生物基因治疗一站式解决方案

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赛业生物作为一家综合解决方案提供商,建立了多位一体的基因治疗创新性CRO平台服务网络。在过去十余年,赛业生物积累了大量的基因信息数据,在模式动物持续的深耕也让我们在基因编辑技术方面一直走在行业前沿,结合赛业生物在人工智能领域的深度探索,我们可提供高效的基因功能解析与基因治疗一站式解决方案。可为从事基因治疗的研究者提供更高效的基因功能解析与基因治疗一站式解决方案,包括靶点筛选与功能研究,动物模型构建和病毒载体如AAV、LV、ADV等设计与包装,以及表型分析等全流程服务。

 

罕见病数据中心(RDDC)助力罕见病研究与模型构建

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关于赛业

 

赛业生物成立于2006年,是一家借助AI赋能药物研发的创新性CRO公司。目前员工人数超900名,总规模超40000平方米,在中国广州、苏州、固安设立有全资子公司,在成都、北京、上海、武汉、长沙等地设有办事处,在美国Santa Clara和日本东京设有分公司。过去十余年,赛业生物依托于品系丰富的基因编辑小鼠资源库、高效智能化的大小鼠定制平台、规模化的大小鼠快速繁育平台以及严格质控的无菌鼠技术服务平台,在模式动物基因编辑技术方面走在行业前沿,同时也积累了大量的生物信息及基因编辑方面的数据。结合在人工智能领域的深度探索,赛业生物可为从事基因治疗和细胞治疗的研究者提供一站式整体解决方案,包括AI靶点筛选与功能研究、动物模型构建、治疗性载体设计与优化、病毒包装以及药理药效学研究等全流程服务,助力提高基因治疗和细胞治疗基础研究的临床转化效率。

 

目前,赛业生物已和全球100多个国家和地区的科学家及企事业单位建立了广泛的合作,致力于为科研机构及医药产业提供综合的动物模型制备、繁育保种、AI靶点筛选、药理药效评价、基因治疗和细胞治疗领域的科学研究和临床转化等服务。如有需要,欢迎联系我们咨询。

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