rAAV病毒质检QC知识知多点

rAAV的包装生产一般使用三质粒共转染系统，可大致分为以下四个步骤：目的序列制备并克隆至载体、病毒包装、收毒与纯化浓缩、质检。

rAAV的质量对后续的体内实验有着重要的影响，这包括判别rAAV是否具备生物活性和rAAV用量等。因此需要对每批新产的rAAV进行质检。质检通常包括滴度检测、衣壳蛋白纯度检测、基因组大小及纯度检测和生物学活性检测等。

滴度检测指检测rAAV的基因拷贝数，计算每ml病毒液的病毒颗粒中含有的基因组拷贝总数。具有多种检测的手段，包括DNA斑点杂交（dot-blotting）、ELISA、qPCR和ddPCR等，通常使用绝对定量的方法。首先通过建立标准曲线，得知标准品DNA含量与CT值的线性关系。在此基础上，检测出rAAV病毒的CT值，便可以得到病毒的滴度。

rAAV基因组鉴定较为简单，只需要提取rAAV的基因组，再进行琼脂凝胶电泳即可。由于我们已经知道目的序列和两端ITR的整个rAAV基因组大小，所以从电泳结果便可以判别出rAAV是否包含我们目的的片段，此外还能得知是否存在不正确的核酸序列或杂质。

以赛业生物的数据为例，我们包装了多个含有不同目的序列的rAAV2和rAAV8。提取rAAV病毒基因组后，经琼脂糖凝胶电泳检测，可以看到各种组合的基因组大小均符合预期，并且无其他杂带，这样便能说明rAAV基因组大小及纯度是合格的。

图 2 病毒基因组大小及纯度检测

（数据来源：赛业生物）

Line1：rAAV2-CMV-EGFP (20220217）1E+10 (ITR滴度）2623bp

Line2：rAAV8-CMV-luc(C+S)(20220225) 1E+10(ITR滴度)3464bp

Line3：rAAV8-CMV-EGFP(C+S)(20220225） 1E+10(ITR滴度）2623p

Line4：rAAV2-IRES-hrGFP(20210907)1E+10(ITR滴度)3544bp

Line5：rAAV2-CMV-EGFP(20220217）2E+10(ITR滴度)2623bp

Line6：rAAV8-CMV-luc(C+S) (20220225) 2E+10(ITR滴度)3464bp

Line7：rAAV8-CMV-EGFP(C+S)(20220225）2E+10(ITR滴度）2623bp

Line8：rAAV2-IRES-hrGFP(20210907) 2E+10(ITR滴度)3544bp

由于rAAV衣壳蛋白决定了rAAV的感染效力，所以在检测rAAV基因组过后还需检测衣壳蛋白纯度。推荐使用商业化蛋白提取试剂盒，用于提取rAAV的衣壳蛋白，然后再通过SDS-PAGE 考染/银染检测方法，检测rAAV衣壳蛋白的纯度。优质rAAV的衣壳VP1、VP2、VP3的分子量大小分别为87KD、72KD、62KD，且数量比约为1：1：10。

以赛业生物的数据为例，我们包装了多个含有不同目的序列的rAAV8和rAAV9。在提取不同组合的rAAV衣壳蛋白后，分别进行考染和银染。从结果可以看出，不同组合的rAAV衣壳蛋白大小均符合预期，并且VP1、VP2、VP3的条带亮度也符合1：1：10。此外也不存在杂带，所以这个结果是可以说明包装出的rAAV衣壳蛋白纯度较高，间接说明各组rAAV应具备较高的感染活性。

图 3 病毒衣壳蛋白纯度检测

（数据来源：赛业生物）

SDS-PAGE考染：Lane1：rAAV9-CMV-EGFP，3E11vg；Lane2：rAAV9-CMV-Luc，3E11vg；Lane3：rAAV8-CMV-EGFP，3E11vg；Lane4：rAAV8-CMV-Luc，3E11vg；Lane5：rAAV9-CMV-EGFP，1.5E11vg。

SDS-PAGE银染：Lane1：rAAV2-IRES-hrGFP，9E10vg；Lane2：rAAV2-IRES-hrGFP，4.5E10vg；Lane3：rAAV2-IRES-hrGFP，1.5E10vg。

以赛业生物的数据为例，我们用不同类型不同浓度的rAAV感染293T细胞，通过观察荧光和流式检测，鉴定rAAV的感染效率。在荧光强度观察中，rAAV2、rAAV8、rAAV9以MOI=1E5侵染293T细胞，48h后能观察到强烈的荧光信号。

图 4 rAAV感染293T细胞后48h荧光观察（数据来源：赛业生物）

在流式检测中，rAAV2、rAAV8、rAAV9分别以MOI=1E5、1E4、1E3、1E2侵染293T细胞。组合rAAV2-MOI=1E5的GFP阳性率达到99.66%，并且其他的组合也有较高的GFP阳性率。说明包装出的rAAV具有很强的侵染能力。

图 5 rAAV感染293T细胞流式检测

（数据来源：赛业生物）

rAAV的质量对于后续的使用有着重要的影响，为了确保后续实验可以顺利进行，那么在rAAV生产质检这一环节就需要严格把关，以多种指控标准进行检测，务求生产出优质的rAAV。

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