自闭症治疗新方向-南方医科大学南方医院杨新平研究团队揭示NMDAR系统调控自闭症行为的分子机制

通过转录激活子样效应核酸酶(TALEN)技术制备C57BL/6N品系的Htr3a KO小鼠（该小鼠由赛业提供）。小鼠Htr3a基因1号外显子上的11个碱基(GGGGAAGgtaa)作为TALEN靶点，11个碱基的删除导致阅读框发生移码，编码蛋白被破坏。TALEN mRNA经体外转录后注入受精卵用于KO小鼠的产生，使用正向引物和反向引物对缺失的基因组区域进行PCR扩增，并使用Sanger测序进行基因分型。使用8-12周雄性或雌性的KO小鼠，及其同窝的野生型(WT)一同进行行为测试，其他所有测试均使用雄性小鼠。

采用转录激活子样效应核酸酶技术（TALEN）制备Htr3a敲除(KO)小鼠。通过社会交往、社会互动实验、嗅觉习惯/去习惯、自我梳理、新物体识别、情境恐惧条件反射、高架十字迷宫、旷场实验和癫痫易感性实验等行为测试来评估其表型。采用转录组测序寻找潜在表型的分子网络和通路。通过电生理记录、免疫印迹、免疫荧光染色、免疫沉淀和实时荧光定量PCR验证可能的分子机制。用NMDAR拮抗剂美金刚治疗KO小鼠，挽救其表型。

Htr3a基因是否为自闭症疾病的候选基因呢？作者通过基因敲除的手段构建了Htr3a KO小鼠（该小鼠由赛业公司提供）并检验了其自闭症样行为，结果如下：

1、Htr3a KO小鼠表现出自闭症样行为、记忆受损和癫痫发作易感性减弱

对敲除小鼠和野生型小鼠进行自闭症样行为的筛查：包括社交互动、学习记忆和致痫药物的敏感性检测，结果如下：

图1 Htr3a KO小鼠表现出自闭症样行为、记忆受损和戊四唑诱发癫痫易感性减弱

2、Htr3a KO小鼠的锥体神经元出现出动作电位依赖性GABA电流传递功能的增强

人类大脑中的海马体对记忆至关重要，与自闭症和癫痫密切相关，这表明它可能在Htr3a敲除小鼠的行为表型中发挥重要作用。5-羟色胺能系统参与E/I平衡的传递。因此，作者通过全细胞电压钳记录了海马CA1区锥体神经元上的sEPSCs和sIPSCs，结果如下：

图2 Htr3a敲除小鼠CA1区锥体神经元的动作电位依赖性GABA电流输入增强

3、NMDAR通路的上调是自闭症、学习/记忆受损和癫痫背后共同的分子机制

为了进一步探索Htr3a敲除小鼠潜在的分子机制，作者进行了转录组分析，结果如下：

图3 自闭症、学习/记忆和癫痫的共同分子网络

4、PV⁺中间神经元中NMDAR功能的增加

(CCK⁺)-锥体神经元抑制连接和CCK⁺-PV⁺-锥体神经元去抑制连接均控制海马锥体神经元的GABA电流的输入，作者用P/Q钙通道拮抗剂ω-agatoxin-TK记录sIPSCs的变化，结果如下：

图4 NMDAR上调可以增加Htr3a敲除小鼠PV⁺中间神经元的兴奋性

5、通过NMDAR阻断可以挽救Htr3a敲除小鼠的自闭症样缺陷

为了验证自闭症样行为中NMDAR的上调，采用美金刚胺(5mg/kg)进行NMDAR抑制，结果如下：

图5 通过NMDAR阻断可以挽救Htr3a敲除小鼠的自闭症样缺陷

该研究数据表明，PV⁺中间神经元中NMDAR的上调可能在调节锥体神经元GABA的输入中发挥了重要的作用，并可能参与HTR3A缺乏导致的自闭症的发病机制。因此，作者认为NMDAR系统可以被认为是自闭症的潜在治疗靶点。

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