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引起肥厚性心肌病的主要致病基因——Myh7基因编辑小鼠【每周一鼠】
肥厚性心肌病（Hypertrophic cardiomyopathy，HCM）是一种原因不明的心肌疾病，特征为心室壁呈不对称性肥厚，常侵及室间隔，心室内腔变小，左心室血液充盈受阻，左心室舒张期顺应性下降。根据左心室流出道有无梗阻分为梗阻性及非梗阻性肥厚型心肌病，是常染色体显性遗传性疾病。HCM60%～70%为家族性，30%～40%为散发性，家族性病例、散发病例、儿童病例和成年病例具有同样的致病基因突变。目前已证实，至少14个基因突变与肥厚型心肌病的发病有关，其中有10种是编码肌小节结构蛋白的基因，绝大部分突变位于这些基因[1-2]。
赛业生物《每周一鼠》，每周五更新，为大家讲解一个小鼠模型的故事，希望对大家了解不同的小鼠模型有所帮助。今天和大家见面的是Myh7基因编辑小鼠。
Myh7基因简介
Myh7基因位于小鼠14号染色体上，是一种六聚体蛋白，含有2个重链亚基、2个碱金属轻链亚基和2个调节轻链亚基。该基因编码心脏肌球蛋白的β重链亚基。它主要在正常人的心室中表达，除此之外还在富含I型慢肌纤维的骨骼肌组织中表达。这种蛋白质的相对丰度和心肌肌球蛋白的α重亚基的变化与心肌的收缩速度相关。在甲状腺激素耗竭和血流动力学超负荷期间，它的表达也会发生改变。该基因的突变与家族性肥厚性心肌病、肌球蛋白贮积性肌病、左心室非致密化心肌病、扩张型心肌病和Laing远端肌病有关。其相关通路包括嗜酸性粒细胞中的免疫反应CCR3信号传导和PAK通路。
图1 Myh7基因相关信息
来源：RDDC罕见病数据中心
位于β-心肌肌球蛋白头部结构域的Myh7错义突变是HCM的常见原因。Myh7基因的等位基因是突发转录的，很可能导致细胞之间的等位基因失衡。相比之下，由Myh7突变引起的骨骼肌病很少见。在HCM患者中，突变导致心肌细胞产生力的改变，如Myh7突变中，从细胞到细胞的突变型和野生型肌节蛋白的不同部分可能导致单个细胞的不同表型。除了突变本身的主要功能影响外，这种表型异质性还可能增加疾病严重程度[3]。
Mecp2相关疾病介绍
肥厚型心肌病是最常见的遗传性心脏病之一，发病率为1:500[4]。肥厚型心肌病有猝死风险，是青少年和运动员心源性猝死的最常见原因。HCM的发病年龄、发病程度和猝死风险等临床表型具有多样性，通常呈常染色体显性遗传。目前已报道的HCM相关突变超过900种，主要定位在β-肌球蛋白重链基因、肌球蛋白结合蛋白C基因、心脏肌钙蛋白T基因等13个心脏肌节蛋白基因。
HCM患者在临床上一般表现出呼吸困难、胸痛、心悸、晕厥及心源性猝死（Sudden cardiac death，SCD）。其中，SCD是HCM最严重的表型，往往是HCM患者的首次症状表现。HCM患者心律不齐的易感性增加，成为影响发病率和死亡率的重要因素。67%的心脏肥厚为不对称型，主要涉及主动脉下室间隔。右心室肥厚和双心室肥厚的病例较少见。HCM患者心室壁厚度通常在15至30mm之间，曾报道的最厚心室壁厚度为60mm。
HCM疾病模型—Myh7基因编辑小鼠
Myh7编码的心肌肌球蛋白重链亚基（β-myosin heavy chain, β-MHC）是心脏粗纤维的重要结构成分，对心脏收缩功能至关重要。为研究Myh7基因对HCM疾病发生发展的影响，研究人员将YFP插入到Myh7基因ATG的位置，构建了一个YFP-β-MHC融合等位基因模型。
图2 β-MHC融合等位基因的产生[5]
图注：WT β-MHC基因(上)和靶向结构(下)。胚胎干细胞中的靶向等位基因(中)。种系传递后的YFP-β-MHC融合等位基因(下)。
接下来，研究人员使用携带1拷贝融合基因和1拷贝WT β-MHC基因(Yb/+，以下简称Yb)的杂合子转基因动物进行研究。为了验证转基因动物的表达模式，分别对1日龄新生子鼠，8日龄鼠和9个月大的成年鼠心室切面进行共聚焦显微镜检查。结果如图3所示，在正常动物中，与年龄相关的β-MHC表达的增加是由少数细胞簇中β-MHC表达水平的大幅增加介导的，而不是大多数细胞表达水平小幅度均匀增加的结果。
图3 YFP-β-MHC融合蛋白的发育调控[5]
图注：1日龄新生鼠(A和B)，8日龄鼠(C和D)和9个月大的成年鼠(E和F)心室切面共聚焦黄色荧光图像。
左心室非致密化心肌病（Left ventricular noncompaction cardiomyopathy，LVNC）患者也可能同时患有另一种类型的心肌疾病（肥厚型心肌病、扩张型心肌病或限制性心肌病）。为了调查该家族中LVNC的潜在遗传原因，研究人员对患者的直系亲属进行了全外显子组测序，确定了三个最感兴趣的单核苷酸变体Myh7、MKL2、NKX2–5。其中，为了评估Myh7的体内功能结果，研究人员通过CRISPR-Cas基因编辑，使用200碱基对（bp）单链未修饰寡核苷酸（oligo）供体制作，最终生成了具有直向同源错义变体的小鼠 （C57BL/6J）。
图4 小鼠Myh7同源位点显示Cas靶向方案[6]
图注：基因组序列显示Cas靶向序列(紫色)和PAM位点(绿色)。蓝色表示目标小鼠的核苷酸突变。单链供体序列位于中间底部，突变的核苷酸用红色表示。
既往的研究结果显示，内切酶介导的Myh7等位基因纯合的小鼠在器官发生过程中会表现出完全的胚胎致死能力。由此，研究人员将动物培育成纯合子，并对个体错义变体在体内的影响进行测试。结果显示纯合小鼠在胚胎日（E）9.5-10.0时死亡，并发现伴有心力衰竭。该研究证实Myh7 L387F替代具有破坏性，且在Myh7中鉴定的单核苷酸变体对编码蛋白在纯合小鼠模型中促进心室发育的能力产生不利影响。
图5 小鼠疾病相关SNV的功能评估[6]
图注：代表性Myh7L387F/+xMyh7L387F/+交叉的E9.5胚胎的左侧图像。h,头;lv，左心室；a，中庭。
赛业小鼠模型构建
赛业生物通过CRISPR技术构建了C57BL/6J-Myh7em1(flox)Cya基因敲除活体小鼠，现已加入『红鼠资源库』，快至两周发货。
Myh7基因敲除小鼠
小鼠福利，限定发放中~
品系名称：C57BL/6J-Myh7em1(flox)Cya
品系编号：CKOCMP-140781-Myh7-B6J-VA
应用方向：
❖ 胚胎发育异常
❖ 血流动力学研究
❖ 肥厚性心肌病等心脏相关疾病研究
打靶方案：
Myh7基因条件性敲除小鼠打靶方案示意图
总结
HCM是致病基因、修饰基因及环境等因素共同作用的结果，具有广泛的临床表现和内表型异质性，HCM的发生可能涉及多个独立的信号通路。寻找HCM的病因需要更综合的、系统范围的、分子网络引导的方法。目前，临床上HCM的药物治疗基本上是经验性的，没有直接作用于HCM病因的针对性药物，在防止、减弱和逆转HCM或影响其发生方面并没有突出的疗效。Myh7是HCM主要致病原因之一，同时也与LVNC疾病有关。研究统计发现LVNC患者可能同时患有HCM，为了制定出更加简便、高效的治疗方法，可由此设想出同时作用于两种疾病的有效药物。
因此，充分了解Myh7基因与HCM、LVNC之间的关联，可为以上两种心脏相关性疾病的治疗和新药研发提供一定的理论基础和研究方向。
红鼠资源库
赛业“红鼠资源库”可以为您提供包括Myh7、Eif4g3、Abl2在内的多系列的完全性敲除小鼠和条件性敲除小鼠模型。强大的数据库给您更便捷的体验，研究人员能够在线查询、设计和优化基因编辑方案并比较研究数据和成果，并咨询订购。如有需要，欢迎拨打400-680-8038或后台留言或扫码联系我们咨询订购~
参考文献
[1]Maron BJ, Ommen SR, Semsarian C, Spirito P, Olivotto I, Maron MS. Hypertrophic cardiomyopathy: present and future, with translation into contemporary cardiovascular medicine. J Am Coll Cardiol. 2014;64(1):83–99. doi: 10.1016/j.jacc.2014.05.003
[2]Montag J, Petersen B, Flögel AK, Becker E, Lucas-Hahn A, Cost GJ, Mühlfeld C, Kraft T, Niemann H, Brenner B. Successful knock-in of Hypertrophic Cardiomyopathy-mutation R723G into the Myh7 gene mimics HCM pathology in pigs. Sci Rep. 2018 Mar 19;8(1):4786. doi: 10.1038/s41598-018-22936-z. PMID: 29555974; PMCID: PMC5859159.
[3]Montag J, Kraft T. Stochastic allelic expression as trigger for contractile imbalance in hypertrophic cardiomyopathy. Biophys Rev. 2020 Aug;12(4):1055-1064. doi: 10.1007/s12551-020-00719-z. Epub 2020 Jul 13. PMID: 32661905; PMCID: PMC7429642.
[4]SONG Yan-Rui, LIU Zhong, GU Chu-Lian, JIAN Li-Juan, YAN Qiang-Feng. Advances in the molecular pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy[J]. HEREDITAS, 2011, 33(6): 549-557.
[5]Pandya Kumar., Kim Hyung-Suk., Smithies Oliver.(2006). Fibrosis, not cell size, delineates beta-myosin heavy chain reexpression during cardiac hypertrophy and normal aging in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A, 103(45), 16864-9. doi:10.1073/pnas.0607700103
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[5]Albert Sanfeliu1, Karsten Hokamp, Michael Gill1, Daniela Tropea.Transcriptomic Analysis of Mecp2 Mutant Mice Reveals Differentially Expressed Genes and Altered Mechanisms in Both Blood and Brain. Frontiers in Psychiatry.29 April 2019. doi: 10.3389/fpsyt.2019.00278.
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