专访中山大学青年学者梁思佳：抑制动脉粥样硬化的潜在治疗靶点NFATc3 —— 应用基因编辑小鼠模型研究NFATc3参与动脉粥样硬化发生的机制

中山大学中山医学院梁思佳老师致力于代谢性心血管疾病，特别是高脂血症诱导的心血管相关疾病致病机制的研究，系统研究心血管系统钙池操纵性钙通道和钙激活氯通道在疾病中的病理学意义。近年来梁思佳老师在抗动脉粥样硬化的潜在治疗靶点的发现上取得重大进展，并在European Heart Journal（IF=35.86）上发表重要研究论文，表明 NFATc3可能是抗动脉粥样硬化的潜在治疗靶点，基于该研究论文中应用基因编辑小鼠模型研究NFATc3基因参与小鼠动脉粥样硬化发生机制的思路与策略，赛业生物首席科学家俞晓峰博士，对中山大学中山医学院梁思佳老师进行了特邀专访。

俞博士：我们知道，ApoE和Ldlr基因敲除（KO）是动脉粥样硬化小鼠的常见疾病模型，梁老师的此研究项目中为什么会选择NFATc3基因在冠状动脉粥样硬化致病作用机制开展如此深入探讨研究，能否介绍一下其背后的理论及临床方面的相关依据？

梁老师：我们团队一直在围绕离子通道与代谢性心血管疾病做系统的研究，其中在针对钙信号与动脉粥样硬化关系研究的前期工作中发现，钙池操纵性钙通道介导的钙离子内流，可促进动脉粥样硬化的发生。有意思的是，该钙信号的下游机制是通过激活Calcineurin-ASK1-MAPK信号发挥上述作用，而非通过经典的下游信号NFAT。恰恰相反，NFAT信号的激活加速了泡沫细胞的形成。我们通过对NFAT家族成员（NFATc1-4）之一的NFATc3表达量比较研究发现，与正常人群相比，NFATc3基因表达在临床上动脉粥样硬化患者人群中明显降低。而在高脂饲养ApoE敲除小鼠诱导的动脉粥样硬化疾病模型中也发现NFATc3基因表达呈现负相关。另外，非常值得注意的是，目前我们对器官移植患者的临床监测发现，使用抑制NFAT信号的环孢霉素A等常用免疫抑制剂来发挥免疫抑制作用，进而诱发移植患者出现高脂血症和动脉粥样硬化等药物副作用，已成为器官移植失败导致死亡的最主要诱因。

关于上述免疫抑制剂应用中的不良反应，是否与抑制Calcineurin-NFAT有直接关联，尚一无所知。因此，围绕以上前期相关工作提示和临床现象，我们关注了NFATc3基因的功能研究，并深入开展了后续的作用机制探讨，这份工作首次阐明了NFATc3基因在动脉粥样硬化致病过程中重要作用的关键因素，并揭示了在临床免疫抑制剂应用中，诱发动脉粥样硬化副作用的新机制。这份研究有望为今后提高心脏移植患者生存率，延长免疫抑制药物作用时间，以及人工心脏使用寿命等治疗方案的研究提供了临床前动物实验依据。

俞博士：梁老师在该研究中应用了NFATc3基因编辑小鼠疾病模型，探讨与揭示该基因冠状动脉粥样硬化致病作用，为什么会选择性将该基因在巨噬细胞中特异性敲除？

梁老师：我们知道巨噬细胞泡沫化是动脉粥样硬化斑块形成的关键因素，其在动脉粥样硬化形成中的重要性，以及它们在斑块内的富集，使巨噬细胞成为动脉粥样硬化的有希望的治疗靶点。 而且，我们在研究中发现NFATc3 表达在人和小鼠动脉粥样硬化病变内的巨噬细胞中降低。这种表达水平的降低主要体现在巨噬细胞核内聚积的减少，且与临床动脉粥样硬化患者斑块不稳定性呈密切负相关。然而高脂等动脉粥样硬化刺激对NFAT家族其他亚型在巨噬细胞细胞中的核定位并没有显著影响。因此，我们的工作把NFATc3主要聚焦在单核巨噬细胞功能调控上。

俞博士：在研究基因组织细胞特异性功能作用的时候，一般会采用条件性基因敲除（cKO），或者条件性过表达的策略构建相应小鼠模型，而梁老师在该研究中，不仅构建了该基因的cKO小鼠模型，为什么还要构建巨噬细胞特异性表达NFATc3基因小鼠模型？

梁老师：构建巨噬细胞特异性过表达NFATc3基因小鼠模型是为了探究巨噬细胞过表达NFATc3基因后，能否产生与巨噬细胞特异性敲除NFATc3相匹配的表型效应，从而去验证NFATc3基因在动脉粥样硬化进程中的关键作用。除此之外，我们还通过骨髓移植的方式，进一步去证明NFATc3在单核巨噬细胞中的关键作用。

俞博士：我注意到梁老师在冠状动脉粥样硬化小鼠疾病模型建立中，是采用在NFATc3基因巨噬细胞特异性敲除小鼠上，再导入AAV8-CD36-hPCSK9-D374Y (hPCSK9^DY）突变体巨噬细胞特异性表达的策略，这是不是间接表明，NFATc3基因在小鼠巨噬细胞中敲除，需要加上hPCSK9^DY条件性表达的协同作用，才能诱导小鼠形成冠状动脉粥样硬化的表型？如果采用NFATc3 cKO小鼠与ApoE/Ldlr KO交配的方式获得双基因敲除小鼠模型，是否也有可能开展类似致病作用机制的研究？

梁老师：我们在研究中发现，单纯敲除或高表达巨噬细胞NFATc3不影响动脉粥样硬化的发生发展，也就说明巨噬细胞敲除NFATc3并不能自发动脉粥样硬化。与绝大部分研究相似，这需要在ApoE/Ldlr 敲除背景下进行相关研究。PCSK9突变体诱导动脉粥样硬化是近来年相关领域越来越常用的一种技术手段。PCSK9^DY是前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin-9第374位天冬氨酸突变为酪氨酸的功能获得性突变体，通过高效降解LDLR提高LDL-C水平，促进动脉粥样硬化形成，其作用与Ldlr ^-/-小鼠诱导动脉粥样硬化的原理相似。这种动脉粥样硬化模型诱导方式可以极大节省基因修饰动物与ApoE/Ldlr敲除小鼠杂交所需时间，尤其是条件特异性表达小鼠。

俞博士：你们的研究揭示了NFATc3通过调节miR-204-5p/3p表达，分别抑制清道夫受体SR-A和CD36水平，达到防止泡沫细胞形成和冠状动脉粥样硬化的作用机制，该研究成果为深入开展冠状动脉硬化作用机制方面的研究，以及临床上该疾病的防治提供了哪些指导意义？

梁老师：我们认为从基础研究角度来说，证明了NFATc3 / miR-204轴是动脉粥样硬化发生发展的一个关键因素。首次发现miR-204-3p特异性定位于巨噬细胞核中，通过抑制Ago2、H3K27ac和H3K4me3在CD36启动子上的富集从而抑制CD36的转录，与miRNA靶向目标mRNA  3'-UTR经典调控机制极为不同。临床指导意义上，揭示了环孢霉素A等免疫抑制剂诱发动脉粥样硬化副作用的分子机理。但是，需要注意的是，考虑到对于器官移植患者而言，直接干预NFAT可能会同时影响免疫抑制效应，说明其下游关键调节因子miR-204可能是免疫抑制剂动脉粥样硬化一个更为理想防治靶点，这也需要我们后续更深入的研究。

专家简介

梁思佳，中山大学中山医学院，副教授。现任中国药理学会心血管药理专业委员会副秘书长，中国药理学会心血管药理青年委员会副主委，中国药理学会生化与分子药理学青年委员会委员。致力于代谢性心血管疾病发病，特别是高脂血症诱导心血管疾病致病机制研究。近年来以第一或通讯作者在Eur Heart J、Adv Sci、ATVB等SCI杂志发表论著12篇，其中6篇IF>10，2篇IF>30。主持国家自然科学基金3项；申请国家发明专利2项；参编教材2部。

俞晓峰，赛业生物中国区副总裁兼首席科学家。军事医学科学院博士，国际知名模式动物和细胞生物学专家，耶鲁大学医学院和纽约大学医学院研究员，美国基因打靶公司（iTL）和应用干细胞公司（ASC）资深科学家。在基因修饰模式动物领域有超过20多年研发与管理等方面的丰富经验，在干细胞相关领域及哺乳动物细胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次发表在 Nat Immunol、Hum Mol Genet、Mol Cell Biol 等高水平杂志上。