研究ATP能量运输的关键基因——P2rx7基因编辑小鼠【每周一鼠】

P2rx7基因，又称P2X7R、P2X（7），位于小鼠的5号染色体上，该基因在ATP能量代谢过程中起着至关重要的作用。它是一种在上皮细胞和免疫效应细胞上表达的细胞外ATP门控阳离子通道^[1]，能够影响T调节细胞功能^[2]、促炎细胞因子的产生、细胞死亡的调节、感染性病原体的消除等等。并且ATP-P2X7R通路在自身免疫性疾病和炎症性肠病等慢性炎症性疾病中扮演着重要角色^[3]。

P2rx7编码的蛋白能够实现多种功能，包括ATP结合活性、细胞外ATP门控阳离子通道活性、与脂多糖结合活性、参与细胞体积的负性调节和对疼痛的感觉感知等等。并且参与调控包括有机磷酸酯运输在内的多个过程的上游或内部、细胞因子产生的正调控和分泌的正向调节。该蛋白位于几个细胞组成部分，包括质膜外侧、神经肌肉接头和神经元细胞体，是质膜的重要组成部分。其在生物体大脑、心脏和肾脏中有明显表达。

图1 P2rx7基因相关信息

来源：RDDC罕见病数据中心

（https://rddc.tsinghua-gd.org/details/gene?gene=GD4ALG）

结肠炎相关癌症（CAC）是炎症性肠病（IBD）的并发症。胞外ATP与嘌呤能受体P2RX7的结合是控制肠道炎症的关键因素，起到限制促炎肥大细胞和细胞因子升高并促进调节性T细胞（Treg）和肠神经元存活的作用。研究者研究了P2RX7阻断在已建立的CAC小鼠模型中的作用。结果发现，虽然P2RX7介导炎症反应，但它也能在早期起到抑制CAC发展的作用。P2RX7阻断增强了肠上皮细胞的增殖并保护其免于凋亡。P2RX7阻断的增殖作用与刺激肠上皮细胞增殖的TGFβ1升高有关。最后，P2RX7阻断还改变了免疫细胞浸润，并促进了Treg在消化系统病变内的积累。

图2 P2rx7基因的敲除方案策略^[4]

（简称如下：B,BamHI；RV，EcoRV；K，KpnI；S，SalI）

研究者首先通过ES打靶技术将Neo筛选元件插入到P2rx7基因的一个外显子中，破坏了羧基端编码区，建立P2rx7基因敲除小鼠。再通过化学药物诱导的方式构建结肠炎相关癌症模型^[5]。模型建立成功后，使用硫酸葡聚糖（DSS）进行治疗，与对照组相比，P2rx7^-/-小鼠从炎症病变中恢复得更快，P2RX7的遗传和药理学失活都抑制了DSS诱导的结肠炎症。

图3 结肠组织的HE染色和炎症评分^[5]

后续为了研究P2RX7对炎症诱导的结肠直肠癌的影响，偶氮甲烷诱导的小鼠接受了三个周期的DSS以模拟慢性结肠炎。治疗结束后，P2rx7^-/-小鼠显示出更高的疾病活动评分，并且与WT小鼠（每只小鼠平均2个息肉）相比，小鼠出现明显更多的肉眼息肉（每只小鼠平均9个息肉）。正如对CAC模型所预期的那样，在WT小鼠中肿瘤位于结肠的远端，而在P2rx7^-/-小鼠中它们侵入到结肠的内侧部分。这些结果表明P2RX7功能的改变促进了肿瘤的进展。

图4 P2RX7活性对肿瘤组织发展的影响^[5]

以上结果表明，P2RX7失活会抑制炎症，但同时会增强肿瘤易感性。总之，研究结果揭示了P2RX7在预防CAC中的意外作用，提示在使用P2RX7抑制剂治疗IBD时要谨慎，因为可能会增加CAC的风险。

P2RX7通道参与各种中枢神经系统疾病的发病机制。越来越多的研究表明，它存在于神经元中，但其具体表达部分和功能一直存在争议。为了解决这一问题，研究者构建了P2RX7 BAC转基因小鼠，并在体内可视化功能性EGFP标记的P2RX7受体。对小鼠模型的广泛表征揭示了显性P2RX7-EGFP蛋白在小胶质细胞、伯格曼胶质细胞和少突胶质细胞中的表达，但在神经元细胞中没有表达。

图5 P2RX7基因的转基因载体构建流程图^[6]

研究人员为了确定P2RX7在大脑中定位的总体模式，对所有小鼠系的脑切片进行了3，3'-二氨基联苯胺（DAB）染色，如图6。结果显示在小脑皮层的分子层中发现了特别高的P2RX7-EGFP密度（图6A）。此外，在齿状回（DG）、大脑皮层和嗅球以及丘脑、下丘脑、黑质和腹脑桥的分子层中检测到强荧光标记。不同大脑区域显示出相似的蛋白质比例和组织特异性强度（图6B），表明转基因的表达反映了内源性P2RX7的表达模式和表达水平，从而暗示控制P2RX7表达的重要调节元件在所选的BAC构建体中得以保留和功能。除了伯格曼胶质细胞（图6C）外，P2RX7还存在于小脑的小胶质细胞中。

图6 转基因P2RX7-EGFP的分布格局^[6]

A,脑部抗GFP抗体的DAB染色；B,不同大脑区域中转基因和内源性P2RX7蛋白的比例;C,小脑与抗GFP和S100β抗体共同标记,可见桡侧神经胶质细胞的典型染色模式。

研究者后续使用细胞类型特异性标记物（图7A–F）和海马体CA1区域中GFP阳性细胞的定量（图7G）证明P2RX7-EGFP主要在小胶质细胞中表达（占所有Iba1阳性细胞的93%），而其余GFP阳性细胞中的大多数属于少突胶质细胞谱系并共表达Olig2（如图7）。

图7 P2RX7-EGFP在CA1区域中表达细胞类型的同一性和数量^[6]

A-F,转基因小鼠脑切片与抗GFP抗体、针对指示标记蛋白与S100β（S2532，西格玛奥德里奇）的抗体。图中显示了海马CA1区域；G,流式细胞分析

综上所述，在中枢神经系统，P2RX7主要位于小胶质细胞和少突胶质细胞中，并且少量位于大脑中的S100β阳性细胞以及小脑中的伯格曼胶质细胞中。鉴于生理学上的这种分布，以及在神经组织损伤或癫痫持续状态后没有观察到神经元中P2RX7蛋白的上调，可以得出，报告的P2RX7依赖性神经元损伤是小胶质细胞激活的明显表现的结果，而不是神经元P2RX7受体的直接激活。

P2rx7基因作为ATP能量代谢通路中的关键基因，能够影响机体免疫系统的调控，影响炎症发生与癌症发展，并且参与神经系统疾病的发病机制调节。P2rx7基因编辑模型可以用于结肠炎相关癌症与神经系统等领域的研究，P2RX7失活会抑制炎症，但同时会增强肿瘤易感性；在中枢神经系统中主要表达于小胶质细胞和少突胶质细胞中，并且少量存在于大脑中的S100β阳性细胞以及小脑中的伯格曼胶质细胞中。P2rx7基因编辑模型为结肠炎相关癌症的研究以及P2rx7在脑组织中的定位研究和神经疾病的发病机制研究提供了平台，具有广泛的科研意义。

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