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专题：CRISPR基因编辑技术应用研究及相关进展

日期: 2017年03月21日

[赛业生物]近年来，CRISPR这项基因编辑技术在短短几年内成为生物学领域的科学界们关注的焦点，并迅速应用于各大实验室开展相关科学研究，发表了大量学术文章和取得突破性研究成果。在本专题中，赛业生物科技有限公司高级科学家俞晓峰博士针对CRISPR的技术原理、CRISPR在模式动物/人类疾病/基因治疗等方面的应用以及CRISPR的局限性和前景等一系列关键问题进行了详细分析与讲解！

1、CRISPR的概述

CRISPR基因编辑技术1

1.1 CRISPR介绍

CRISPR基因编辑技术的发现来自细菌抵抗病毒入侵的免疫机制。CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是对细菌基因组中某种特殊重复序列结构的简称，即成簇规律间隔的短回文重复序列。当同样的病毒再次感染细菌时，这些由于病毒感染细菌后在细菌基因组中形成的特殊重复序列，可以根据入侵病毒DNA序列的特点，形成特异且互补靶序列的引导RNA（guide RNA）, 并与细菌自身的Cas9核酸酶（常用能切割双链DNA的蛋白）形成复合物，使原本非特异性的Cas9核酸酶活性转化为能特异性切割双链DNA的作用，达到特异性抗病毒的免疫防御目的。

1.2 CRISPR技术原理

CRISPR基因编辑技术是通过设计与构建针对靶基因DNA序列（～22bp）互补的引导RNA，并与Cas9核酸酶一起直接导入实验动物的生殖细胞，因特异性引导RNA的定位，Cas9核酸酶对靶DNA进行特异性切割，造成双链靶DNA 的断裂，诱发内源性DNA的非同源末端修复机制（non-homologous end joining，NHEJ），而修复过程则会引起DNA核苷酸的缺失或增加等错配，导致基因移码突变，实现基因敲除（Knockout, KO）模式动物建立的目的。如果需要对目的基因进行特定修饰（点突变，基因插入等），则要在CRISPR基因敲除构建策略的基础上，添加计划插入修饰的DNA片段（donor DNA），达到对特定基因插入和替换遗传修饰。

1.3 CRISPR特点

继ZFN和TALEN基因编辑技术之后，CRISPR技术具有操作简便，效率高，特异性强，应用广泛等优势被称之为新一代（或第三代）基因编辑技术。

2、CRISPR在模式动物研究中的应用

CRISPR基因编辑技术2

至2012年CRISPR技术成功应用于真核生物细胞基因修饰以来，该基因编辑技术已成功应用于酵母，果蝇，线虫，斑马鱼，小鼠，大鼠，猪，猴，以及各种哺乳类动物和人的细胞系等基因的修饰。

2.1在哺乳类动物基因修饰模式动物的研制

上世纪70年代，首次应用外源DNA直接导入小鼠生殖细胞而建立的转基因（Transgenic）技术，开创了遗传修饰模式动物研制的基础，为基因功能（gain of function）研究提供了有效工具。随着80年代体外培养小鼠胚胎干细胞（ES）的成功，以及DNA同源重组技术的完善，ES基因打靶技术（gene targeting）的创立与发展，使构建各类复杂遗传修饰小鼠模型成为可能。ES基因打靶技术也成为过去30多年遗传修饰模式动物研制的主要方法，为基因功能研究，疾病模型建立，以及防治药物研制与评估提供了理想的工具。然而，转基因技术的随机插入，ES打靶技术的小鼠ES体外培养等某些局限性，一定程度上限制了此类基因修饰技术的广泛应用。CRISPR基因编辑技术的出现则是对现有基因修饰技术的补充与改进。

CRISPR基因编辑技术绕过了ES打靶技术的细胞体外同源重组过程，直接通过原核注射的方法，在生殖细胞内对特定基因进行修饰而获得遗传修饰的模式动物。因此，CRISPR技术几乎可应用任何哺乳类动物基因修饰模式动物的研制。

2.2基因敲除小鼠模型以及疾病模型制作

目前，除了大量关于CRISPR技术构建基因敲除小鼠与大鼠模型的报道外，也有各种基因定点敲入小鼠模型，条件性基因敲除小鼠模型，以及小鼠疾病模型等成功报道。如美国MIT张峰研究组应用传统ES打靶技术，首次构建了对Cas9基因表达可实施组织特异性调控的小鼠模型（条件性Cas9小鼠），在此基础上，他们应用CRISPR技术设计肺癌相关基因（如Kras，p53和Lkb1）的引导RNA, 通过AAV9病毒载体，将相应的引导RNA导入条件性Cas9小鼠的肺部，成功建立了小鼠特异性肺癌模型。当然，在此条件性Cas9小鼠模型上，也可通过设计特定基因的引导RNA，构建针对不同基因的组织特异性敲除小鼠模型。

2.3对大动物基因及多基因同时改造修饰

应用CRISR技术也成功对猪，猴等大动物基因进行改造修饰，而这是传统基因修饰技术难以实现的。由于CRISPR基因编辑技术中针对靶基因的引导RNA非常小且构建方便，这为该技术用于多个基因的同时修饰提供了可能性。目前已有通过一次原核注射同时敲除三个基因的小鼠和猴模型的成功例子。

在开始应用CRISPR基因编辑技术构建基因敲除动物模型时，通常原则是通过设计能导致靶基因DNA序列移码突变的策略。为了真正确保基因敲除的保险效果，目前推荐的策略则是参照传统ES打靶技术的设计理念，在计划敲除DNA片段的两端设计各自的引导RNA，以达到敲除靶基因的DNA片段，从而获得靶基因功能完全敲除的模式动物。

3、CRISPR在基因治疗方面的应用前景

CRISPR基因编辑技术3

传统基因治疗（gene therapy）技术通常是通过导入正常基因的方式来治疗基因缺陷相关的相关遗传性疾病，而新一代基因编辑技术CRISPR的出现，使其在基因治疗方面的优势更加显而易见的。该技术不仅可以对任何真核生物细胞基因进行敲除，而且可以对特定基因进行替换和改造，避免了转入基因随机插入基因组，造成癌基因激活等潜在风险。而对于那些因基因突变缺失，造成蛋白功能损失的疾病，通过CRISPR技术在相关基因水平上进行改造修复，实现基因功能恢复的治疗作用，这是传统基因治疗技术难以实现的。因此，CRISPR技术有可能成为现代基因治疗技术广泛应用于人遗传性疾病等防治的更优选择。

3.1 在传染性疾病治疗中的应用

应用CRISPR基因编辑技术敲除与疾病发生发展相关的基因达到防治疾病的目的。如HIV病毒是通过感染人细胞上的相关靶点CCR5蛋白而引起AIDS，应用CRISPR技术敲除人血液细胞上靶点CCR5基因，阻碍了HIV入侵人体细胞，达到防治人感染HIV病毒的效果。

3.2 在遗传性视网膜退化疾病中的应用

由于CRISPR基因编辑技术的巨大应用前景与可能的商业利益，目前国外以该技术为基础获得巨额风险投资的生物公司主要有Editas Medicine, CRISPR Therapeutics，Intellia Therapeutics等，主要计划开展相关人遗传病如视网膜退行性疾病、遗传性肌肉疾病以及血液疾病等防治领域的探索性研究。其中利用CRISPR技术治疗人遗传性视网膜退化疾病（LCA），有可能成为最早临床应用的疾病。该遗传性疾病因视网膜相关基因的突变可导致眼睛失眠。在小鼠模型研究中，研究者应用CRISPR技术，改造修复小鼠的相关突变基因，可成功改善小鼠视力。Editas Medicine拟在2017将该基因治疗技术应用临床试验中，这也将是首个CRISPR技术应用于临床研究项目。

3.3 在肌肉营养不良症中的应用

肌肉营养不良症（DMD）是一种X染色体连锁的隐形致命性的遗传性疾病，其特征为患病男孩因某种抗肌肉萎缩的基因（Dystrophin）发生异常突变，造成男孩全身肌肉发育障碍，最终因呼吸与心脏衰竭而多死于20岁左右。目前临床前的小鼠模型试验已经证明，用腺相关病毒（AAV）作为载体，将CRISPR技术相应的引导RNA/Cas9转导入小鼠成年肌肉或血液细胞，敲除细胞内该致病基因的异常部分，使基因的保留部分恢复其正常功能，实现对DMD的基因治疗效果。这无疑为DMD基因疗法今后真正应用临床治疗提供了希望。

3.4 在器官移植的遗传修饰猪模型及人iPSC修饰中的应用

通过CRISPR技术对猪体内引起免疫排斥反应的相关基因以及内源性病毒DNA实施敲除，构建可供器官移植的遗传修饰的猪模型，在临床上将会有非常重要的应用价值。国内南京医科大学的戴一教授通过对器官移植排斥相关的三个猪基因进行敲除，构建了CRISPR敲除猪，为今后开展猪器官移植临床试验奠定了基础。

目前对于应用CRISPR技术进行人生殖细胞相关基因修饰与改造仍然存在着技术与伦理等方面限制。因此，研究者们则采取将CRISPR技术与人诱导多能干细胞（iPSC）相结合，在体外对相应基因进行修饰，再将改造过的iPSC 应用到人相关疾病治疗作为可能的选择方案。

3.5 在CAR-T免疫细胞疗法中的应用

CAR-T细胞（Chimeric antigen receptor-T）作为免疫细胞疗法治疗肿瘤是当前肿瘤免疫疗法热点研究领域之一。2017年初有研究报道，利用CRISPR技术，借助AAV6病毒载体，成功构建小鼠TRAC基因敲除并具有抑制肿瘤细胞生长的CAR-T细胞，用该基因特定敲除的CAR-T细胞治疗肿瘤细胞移植小鼠，可显著延长修饰小鼠存活时间。

3.6 在PD1抗肿瘤治疗中的应用

PD1（Programmed death 1）作为一种免疫抑制分子，已成为重要肿瘤治疗的有效靶分子，针对PD1的人源化抗体已获得FDA批准进入临床治疗肺癌病人。直接利用CRISPR技术敲除PD1基因，验证其在临床试验中治疗人肺癌效果也是目前人们非常关注的领域。华西医院卢铀教授以及美国NIH都已决定将通过CRISPR技术，先在体外敲除人T细胞上PD1基因，然后再将基因修饰的T细胞回输给病人，开展晚期肺癌治疗的临床效果评估。我们将拭目以待，期望理想的结果。

4、CRISPR的局限性

CRISPR基因编辑技术4

CRISPR基因编辑技术真正应用于真核细胞基因的修饰也只有最近几年的时间，该技术仍有不断改进与完善的地方。比如如何提高CRISPR技术的特异性，降低其脱靶效应，仍然是当前该技术在未来实际应用中最需要解决的问题。

4.1 如何提高CRISPR技术的特异性与降低其脱靶效应

目前在如何提高CRISPR特异性方面的研究，多是通过改变Cas9核酸酶的活性与敏感性而进行的，如Cas9缺口酶（nickase）只对双链DNA进行单链缺口切割，达到增加CRISPR技术基因修饰的特异性。另外对Cas9基因本身活性位点进行特定修饰与筛选，获得具有相对于野生型Cas9更强特异性与敏感性的新型Cas9核酸酶如Cas9-HF1和eCas9等将有助于降低CRISPR的脱靶效应。

4.2如何提高传递效率与安全性等问题

常用的SpCas9核酸酶是来自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）, 但其分子较大（1368个氨基酸），不利于被AAV包装应用于基因治疗。来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的SaCas9则相对较小（1053个氨基酸）。而来自于空肠弯曲杆菌（Campylobacterjejuni）的CjCas9（984个氨基酸）是目前发现的最小Cas9核酸酶，且也具有野生型SpCas9核酸酶的切割活性。因此，筛选小分子的Cas9核酸酶仍将是今后人们热衷研究的领域。

如同传统基因疗法技术所面临的问题一样，CRISPR技术应用到人疾病的防治仍需要采用病毒载体作为DNA的传递方式。目前基因治疗中最为常用的AAV载体系统本身也可能存在如传递效率和安全性等问题。另外，在体内长期存在的Cas9核酸酶，有可能产生非特异性切割作用，存在着诱发癌症发生的潜在风险。

4.3如何提高HDR 在非分裂细胞中的效率

应用CRISPR技术对真核细胞基因进行修改是基于同源介导修复（HDR， homology - directed repair）原理实现的。虽然各类细胞中都含有参与HDR 基因存在，但这些基因往往在分裂细胞中才具有活性，而人多数组织细胞如肝，心脏，神经，肌肉，眼睛等都为非分裂细胞。所以，CRISPR的这种HDR作用通常只对处于分裂细胞的作用效果较好，因此，寻找能使非分裂细胞中HDR相关基因激活的机制与方法（如添加相应药物等）将有助于CRISPR技术对这类细胞进行有效的HDR改造修饰。最近有关CRISPR技术对非分裂成体细胞进行基因修饰成功的首次报道，将为今后该技术的实际应用带来希望。

5、CRISPR展望

鉴于CRISPR基因编辑技术具有高效的基因敲除特性，目前应用该技术开展人疾病的临床治疗试验也多是采用敲除整个或部分基因的策略达到治疗目的。如肌肉营养不良症（DMD）就是用CRISPR技术将引起该病发生的某段缺陷基因部分DNA序列敲除掉，保留具有功能活性但较正常小的蛋白部分，达到恢复该基因功能的治疗效果。

在过去20多年，传统基因疗法经历了大起大落的不同时期。新一代CRISPR基因编辑技术的出现及其近几年的快速发展，又一次为基因治疗带来了新的生命与希望。虽然要实现真正理想的目标还需要一定的时间，但CRISPR技术本身的优势不仅使传统基因疗法治疗遗传性疾病更加有效与方便，而且也为需要通过基因改造修饰而达到治疗某些疾病（如遗传性镰刀形红细胞贫血病，免疫相关疾病）等目的提供了可能。相信CRISPR基因编辑技术会在不远的将来给我们带来更多惊喜与希望。[赛业生物:www.cyagen.com]

6、赛业生物

6.1 赛业生物对当前模式动物基因编辑技术的创新

正如前文所述，由于新一代CRISPR基因编辑技术的建立与发展也只有短短几年的时间，在模式动物研究领域的应用仍有一定的局限性，特别是对相对复杂的基因修饰动物模型（如cKO模式动物等）开发存在较大不确定性与风险。而长期作为基因打靶技术金标准的传统ES打靶技术，因小鼠ES体外培养的特殊性，也在一定程度上限制了该技术的广泛应用。因此，提高ES打靶技术效率，缩短其研制周期，则是人们十分期盼的。

赛业生物经过这几年的执着努力，在传统ES基因打靶技术的基础上，创新建立了TurboKnockout®基因敲除技术，该技术跨越传统ES打靶中“低嵌合体阳性率”阶段，同时又实现Neo筛选基因的自删除，从而减少两代繁育时间。TurboKnockout®基因敲除技术不仅避免了CRISPR技术应用中可能的脱靶效应等不足，也使ES打靶周期缩短至 6~8 个月。

另外，赛业生物最近通过其优秀科学家团队的共同合作创新打造的“基因打靶策略专家系统（www.alphaknockout.com）”也极大提高了基因修饰模式动物研发的效率。应用该专家系统，只需输入基因名，10秒即可获取基因打靶设计方案，真正实现在模式动物研制在方案、构建、繁殖等上的创新，为广大科研人员提供更快更专业的模式动物构建技术服务。

6.2 俞晓峰博士

俞晓峰

俞晓峰博士现为赛业生物的高级科学家与技术总监，负责遗传修饰模式动物的研发与技术服务等。俞博士在遗传修饰模式动物领域有超过18年研发与管理等方面的丰富经验，在干细胞相关领域及哺乳动物细胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次发表在Nature Immunology、Hum Mol Genet.、Mol Cell Biol.等高水平杂志上。加入赛业生物前，俞博士2010-2013年任职于美国应用干细胞（ASC）公司，担任研发总监，负责遗传修饰模式动物的研发与定制服务，并在中国子公司斯坦福生物科技担任副总裁一职。2009-2010任纽约大学医学院研究员。2003-2009期间任职于美国基因打靶公司（iTL），作为资深科学家和项目经理负责参与了遗传修饰小鼠模型研发方案与策略设计、项目管理、技术人员指导与培训、以及客户服务与技术咨询等工作，2007年起负责开发了人源化p53基因不同点突变的肿瘤小鼠模型库项目。2000年任美国耶鲁大学医学院研究员。1995年获得军事医学科学院博士学位。

7、关于赛业生物：

赛业生物总部