PCR-free的靶向捕获技术与PCR-free PacBio SMRT测序结合

日期: 2017年09月12日


    

导读:作者首次将无需PCR的CRISPR/Cas9靶向捕获技术与同样无需PCR的PacBio长读长、单分子实时测序(SMRT)技术完美结合,实现了从单碱基分辨率水平对完整的重复扩增区域(5.3~7kb)进行测序和分析,对ATXN10基因型与表型的关系进行深入研究。赛业小编为您推荐本文,详情如下:


高通量测序技术已经被广泛用于疾病基因组特征和分子机制研究,研究策略无非是全基因组测序或是靶向测序,在靶向测序中,常见的靶向富集技术有PCR扩增目的区域或基于探针的靶向捕获技术,但这两种方法都很难绕过一个关键步骤-PCR扩增,使得研究人员无法对原始的基因组区域进行测序,从而无法保证测序结果的真实性和准确性;其次,由于目前大规模使用的二代测序技术短读长的限制,对重复序列扩增引起的疾病的分子机制研究存在巨大挑战。


近期《npj Parkinson's Disease》上发表了Parkinson’s Institute、Houston Methodist Research Institute等多个机构共同完成了六例同一家族中同样具有ATXN10基因重复扩增但具有不同临床表型成员进行深入的基因组特征分析。作者首次将无需PCR的CRISPR/Cas9靶向捕获技术与同样无需PCR的PacBio长读长、单分子实时测序(SMRT)技术完美结合,实现了从单碱基分辨率水平对完整的重复扩增区域(5.3~7kb)进行测序和分析,对ATXN10基因型与表型的关系进行深入研究,发现了新的遗传修饰因子,并初步解释了发生临床表型差异的原因。作者在文中特别指出:“对重复扩增区域进行完整测序,明确致病基因的遗传结构,这对于揭示遗传修饰因子与临床表型的关系具有重大的意义。我们利用单分子测序与CRISPR/Cas9捕获的组合方法成功地鉴定重复扩增的遗传组成,揭示帕金森病和ATXN10之间表型与ATXN10基因型的关联。”


10型脊髓小脑共济失调SCA10背景


SCA是一种临床上和遗传上异质性的神经退行性疾病,以小脑共济失调为主,但常常伴随着多种神经系统症状。如今已经确定,这些疾病是由重复扩增引起的,重复扩增的长度可能对发病年龄、严重程度或疾病进展有影响。其中,22号染色体上ATXN10基因中ATTCT五核苷酸的扩增是SCA10的起因。正常的重复范围在10-32个ATTCT。若重复次数在280-850,则疾病的外显率较低;若重复次数达到850-4500,则疾病完全外显,准确地判断重复次数对于疾病的判断非常关键。


本文所选家系特征


一个来自墨西哥家庭,兄弟姐妹中6人基因组皆具有ATXN10重复扩增,但具有不同的临床表型:


四名患者表现出10型脊髓小脑共济失调(SCA10)临床表型,伴随癫痫和渐进性痴呆等临床特征;


一名患者表现出共济失调及早发性左旋多巴反应性帕金森综合征;


一名家庭成员虽携带了大量的ATXN10重复扩增,但并未出现任何临床症状。


研究目的


期望通过遗传分析技术分析ATXN10基因的重复区域pattern,揭开临床表型差异的根本原因。


主要研究方法


通过CRISPR/Cas9靶向捕获技术获得完整的ATXN10重复扩增序列,然后对富集产物进行PacBio SMRT测序。CRISPR/Cas9靶向富集过程如下:

  

“无需扩增的CRISPR/Cas9富集流程”
图1:无需扩增的CRISPR/Cas9富集流程


测序结果


通过对富集得到ATXN10重复扩增序列进行完整测序,测序结果表明,四名SCA10患者ATTCT 发生480次重复,并同时具有920次ATTCC 重复干扰序列,该重复干扰序列占总重复扩增区域的60%. 而共济失调和帕金森临床症状的患者,具有大于1300次的ATTCT重复,但是不带有ATTCC这种遗传修饰因子,作者认为,这种ATTCC重复干扰序列可以作为一种遗传修饰因子,并推断该遗传修饰因子的缺乏也许在疾病过程中发挥作用,导致多巴反应性帕金森综合征的临床表现。具体ATXN10重复扩增序列pattern如下:

  

“PacBio对ATXN10完整重复扩增序列测序结果展示”
图2,PacBio对ATXN10完整重复扩增序列测序结果展示


原文信息:


Parkinson’s disease associated with pure ATXN10 repeat expansion


npj Parkinson's Disease 3, Article number: 27(2017)


doi:10.1038/s41531-017-0029-x

  

来源:生物通——由赛业生物科技有限公司转载发布

  

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