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Nature子刊:CRISPR衍生系统实现剂量依赖性的表达激活

日期: 2019年11月14日


    

北卡罗来纳大学教堂山分校、国立卫生研究院等机构的研究人员开发出一种基于CRISPR-Cas9的系统,可以利用化学表观遗传修饰因子(CEM)来实现基因表达的激活,而无需使用外源的转录调控蛋白。

 

这项成果于本周发表在《Nature Biotechnology》杂志上。此系统由两部分组成,其一是带有FK506结合蛋白(FKBP)的催化失活Cas9(dCas9),其二则是CEM,它可以招募内源的转录调控因子,从而激活目标基因的表达。

 

作者写道:“我们证明,CEM可以使内源位点的基因表达上调20多倍。我们还证明了转录激活的剂量依赖性控制、在多个不同基因上的作用、CEM活性的可逆性以及我们最佳的CEM在整个基因组中的特异性。”

 

催化失活Cas9(dCas9

图片来源于网络,仅供参考

 

在之前的研究中,科学家证明了CEM能够修饰染色质并抑制改造位点的基因表达。在这项新研究中,他们开发出CEM激活(CEMa)分子,可以招募内源性基因激活机制,包括CEM87、CEM88和CEM114。这些分子分别与不同的转录激活因子相结合。

 

为了检验基因表达的变化,研究人员利用绿色荧光蛋白(GFP)基因转染了HEK293T细胞,并对共表达gRNA和dCas9机制的细胞开展流式分析。他们用共表达dCas9-FKBP×1或dCas9-FKBP×2以及CEMa分子的质粒激活报告基因。在48小时后,他们发现GFP报告基因的表达均有显著增强。

 

在优化dCas9系统后,研究人员选择了两个最有效的CEMa分子(CEM87和CEM114)开展时间进程分析。他们用表达dCas9、MS2-FKBP×2和GFP的质粒转染细胞。与未处理的细胞相比,经过CEM87和CEM114处理的细胞在24小时和48小时后产生了GFP高表达。他们还发现,CEM对目标基因的激活调控是可逆的。

 

为了研究dCas9-CEMa系统的多功能性,研究人员利用靶向白介素1受体拮抗基因(IL1RN)的gRNA进行了测试。与对照细胞相比,经过CEM87处理后,IL1RN基因的表达增强了近96倍。同时,他们还靶向了表达量相对较高的MYC1位点,发现CEM87并未明显增强其表达。

 

作者总结道:“通过CEMa技术与dCas9载体的融合,我们理论上可以通过该系统来靶向基因组中的任何基因。这种dCas9-CEMa技术为靶向疾病相关的基因铺平了道路,有望解答与疾病机理相关的问题。”

 

原文检索

Chiarella, A.M., Butler, K.V., Gryder, B.E. et al. Dose-dependent activation of gene expression is achieved using CRISPR and small molecules that recruit endogenous chromatin machinery. Nat Biotechnol (2019) doi:10.1038/s41587-019-0296-7

 

转载标题:Nature子刊:CRISPR衍生系统实现剂量依赖性的表达激活

 

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