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prime editing:为CRISPR编辑增添精确性和灵活性

日期: 2019年12月03日


    

目前已从人类中鉴定出75,000多个致病性的遗传变异。之前开发的基因组编辑方法只能纠正这些变异中的一小部分。最近,Broad研究所的David Liu实验室开发出一种新技术,为CRISPR编辑世界增添了一份精确性和灵活性。

 

这种新方法名为“prime editing”,于上个月发表在《Nature》杂志上。这是一种“搜索和替换”的基因组编辑技术,可以介导靶向的插入、缺失以及所有的碱基替换。而且,它可以将不同类型的编辑相结合。所有这些都可以在没有双链断裂(DSB)或供体DNA模板的情况下进行。

 

它的原理如何?首先,将经过改造的向导RNA(pegRNA)与prime editor蛋白相结合,pegRNA具有双重功能,既能够将编辑蛋白引导到目标位点,又含有编辑的模板序列。prime editor蛋白则由Cas9切口酶和逆转录酶融合而成。在Cas9切割目标位点之后,逆转录酶以pegRNA作为模板进行逆转录,然后将DNA直接聚合到切口的DNA链上。

 

Cas9与逆转录酶的融合体

 

prime editor:Cas9与逆转录酶的融合体

 

为了减少引入细胞的元件,研究人员将M-MLV逆转录酶与Cas9 H840A切口酶相融合,形成prime editor(PE)。他们还发现方向很重要,将逆转录酶融合到Cas9切口酶的C端可以提高编辑效率。他们将这种复合物成为PE1。

 

之后,David Liu实验室创建并评估了19种带有RT突变的PE1变异体。这些变异体可提高活性,增强模板与位点的结合,提高持续合成能力或改善热稳定性。最后,他们将Cas9切口酶与M-MLV逆转录酶的五突变体相融合,将其称之为PE2。与PE1相比,PE2在不同位点的编辑效率平均高2.3到5.1倍。

 

pegRNA:多功能的向导RNA

 

prime editing的另一重要元件是向导RNA(pegRNA)。它既是向导RNA,又编码了逆转录的模板。与带切口的基因组DNA链互补的序列可以作为引物结合位点(PBS)。PBS序列与目标位点杂交,并作为逆转录的起始点。

 

PE3:解离错配的DNA

 

一旦prime editing在一条链上合成编辑物,那么一条链上的原始序列与另一条链上的编辑序列之间将存在错配。为了指导异源双链的解离以利于编辑,研究人员采用一种之前开发的策略。他们在未编辑的链上引入切口,让细胞利用编辑过的链作为模板来重新合成第二条链。

 

这种prime editing系统就称为PE3,它还需要另外一条sgRNA。利用这条sgRNA,prime editor复合物将未编辑的链切开(此切口与第一次的切口相距甚远,以避免产生双链断裂),从而将编辑效率提高2到3倍。

 

prime editing有何优点?

 

不大受PAM序列的限制

prime editor扩展了CRISPR基因组编辑的范围,因为它可以在靠近或远离PAM位点的位置进行编辑,而不大像其他方法那样受到PAM的限制。对于prime editing,PAM到编辑点的距离可以超过30 bp。

 

碱基编辑更精确(在某些情况下)

之前开发的Base editor只能实现四种类型的碱基替换(C->T、G->A、A->G和T->C),而prime editing可实现所有12种可能的碱基替换。同时,它也更精确。例如,Base editor会编辑窗口内的所有C或A,而prime editor只编辑pegRNA指定的对象。如果你无法接受bystander编辑,建议选择prime editor。

 

不过,在某些情况下,传统的Base editor却是首选。比如,如果目标核苷酸在经典的碱基编辑窗口内,那么碱基编辑的效率更高,插入缺失更少。不过,如果核苷酸位置不佳,那么prime editing效率更高,因为它对PAM位点的依赖性较低。

 

副产物更少

在双链断裂后往往采用同源介导修复(HDR)来实现精确的编辑。但是,Cas9切割的效率较高,而HDR的效率较低。这意味着大多数双链断裂都是通过非同源末端连接来修复的。因此,HDR的效率往往低于10%。相比之下,prime editing在HEK293T细胞中的编辑效率可达到20-50%。

 

作为一种新的基因组编辑方法,prime editing还需要更多的研究。作者在论文中指出,有必要在全基因组范围内研究其脱靶效应,鉴定prime editor对细胞的影响,并评估体外和体内导入策略。

 

Addgene提供David Liu实验室的质粒,感兴趣的读者可在网站(https://www.addgene.org/David_Liu/)上查找。

 

相关文献

Anzalone, A.V., Randolph, P.B., Davis, J.R. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature (2019) doi:10.1038/s41586-019-1711-4

 

转载标题:prime editing:为CRISPR编辑增添精确性和灵活性

 

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