• 侧边栏广告 - 科研奖励基金计划

史上新高CRISPR基因编辑插入效率!化学修饰插入DNA5'末端可获5x效率

日期: 2019年12月25日


    

伊利诺伊州尚帕尼市-伊利诺伊大学的研究人员使用CRISPR-Cas9基因编辑系统将基因插入人细胞,插入效率创史上新高(根据已有报告)。成功率高是利用CRISPR进行临床基因治疗应用的必要步骤。

 

 负责伊利诺伊州卡尔·R·沃斯基因组生物学研究所生物系统设计

 

通过化学修饰待插入DNA的末端,新技术的效率可达到当前方法的五倍。研究人员发现,在人类肾脏293T细胞系中不同的遗传位点的测试情况都得到了改善,在其中一个位点的插入率达到了65%,而之前的最高水平才15%。该研究是在化学和生物分子工程教授Huimin Zhao的带领下进行的,刚刚发表在《Nature Chemical Biology》杂志上。

 

CRISPR是关闭或“敲除”基因的有效工具。但是,在人类细胞中,插入或“敲入”基因的效率并不算高。

 

负责伊利诺伊州卡尔·R·沃斯基因组生物学研究所生物系统设计主题的Zhao说:“一种好的基因敲入方法(knock-in)对于基因治疗应用和研究基因功能的基础生物学研究都很重要。。。利用基因敲入(knock-in),我们可以在任何基因上添加标签,研究其功能,并查看基因表达怎样受到癌症或染色体结构变化的影响。或者在基因治疗应用中,如果某人患有由缺失基因引起的疾病,我们希望能够插入它。”

 

为了寻找提高效率的方法,Zhao的小组研究了13种不同的方法来修饰插入的DNA。他们发现,DNA末端的微小变化能够同时增加插入的速度和效率。

 

研究人员尝试使用CRISPR-Cas9精确靶向插入的特定位点,将不同大小的5’末端修饰的DNA片段(0.7kb-2.5kb)连同50个碱基的同源臂,插入人类胚胎肾293T细胞的基因组中的多个位点,获得前所未有的65%-40%的插入效率。即使插入较大的DNA片段——这是最难插入的片段,效率也提高了2至5倍。他们证实,这种5’端修饰使得在人癌细胞和干细胞的不同位点的插入效率提高可达5倍。

 

“我们推测,由于末端的化学修饰稳定了插入的DNA,插入效率提高了很多,”赵教授说。 “通常,当尝试将DNA转移到细胞中时,它会被酶从末端开始降解。我们认为我们的化学修饰可以保护DNA末端。更多的DNA进入细胞核,并且DNA更稳定,所以这就是为什么我认为它有更高的机会整合到染色体中。”

 

赵的研究小组已经在基因功能研究中使用该方法标记关键的基因。他们特意使用现成的化学试剂来修饰DNA片段,以便其他研究团队可以将相同的方法用于自己的基因研究。

 

“我们过去已经开发了很多敲入方法,但是我们从未想过仅使用化学试剂修饰来增加我们想要插入的DNA的稳定性,”赵说。 “这是一个简单的策略,但是有效。”

 

"An efficient gene knock-in strategy using 5'-modified double-stranded DNA donors with short homology arms"

 

转载标题:史上新高CRISPR基因编辑插入效率!化学修饰插入DNA5'末端可获5x效率

 

本文来自“生物通”,转载的目的在于分享见解。如有侵权,请告知删除!

 

关于赛业

赛业生物历经13年发展,已服务全球数万名科学家,产品和技术已直接应用于包括CNS(Cell,Nature, Science)三大期刊在内的3000余篇学术论文。除了提供基因敲除基因敲入条件性基因敲除模型定制服务外,赛业生物还有专业的手术疾病模型团队,可以提供多种复杂精细的小动物手术疾病模型;国际标准化无菌鼠技术平台可以提供无菌鼠、无菌动物定制服务、微生物菌群移植服务等基于无菌动物模型的各类产品和服务,结合赛业生物成熟稳定的基因编辑小鼠平台,还可帮助您研究菌群与基因的互作机制。

 

模式动物完整解决方案:

TurboKnockout基因敲除小鼠:减少两代繁育时间,ES打靶仅需6个月

CRISPR-Pro基因敲除:基因敲除长达20kb,基因敲入长达10kb

人源化小鼠:平台体系成熟,服务于辉瑞、阿斯利康、恒瑞医药等知名药企

转基因小鼠:Nature等顶级期刊引用,年构建高达10000例