鉴定基因型扩出弱杂带怎么办？小鼠基因型鉴定直播回顾FAQ出炉！

上周四，赛业生物生产中心负责人苏翠主讲的「小鼠基因型鉴定的策略及常见问题」线上课程，以下为本次直播常见问题汇总与解答。

FAQ:

1.鉴定基因型有时候扩出很多弱的杂带怎么办？

2.同一个小鼠的一个基因位点鉴定不出来，其他基因都可以鉴定出来？

3.如果人源化小鼠的插入位点是未知的，该如何设计引物进行鉴定呢?

4.PCR循环数应该怎么选择呢？

5.PCR条带为150bp以下，电泳条带非常模糊，有什么好的方法吗？

Q 鉴定基因型有时候扩出很多弱的杂带怎么办？

1、引物特异性可以用NCBI “Primer-BLAST”进行分析，确定除了目的序列无其他结合位点；

2、设置PCR程序梯度反应，摸索出最佳退火温度；

3、确定聚合酶的延伸温度，不同品牌的聚合酶有不同的延伸温度，要详细咨询厂家技术；

4、循环数适当降低，比如开始是35个循环，可以调低至30个循环。

Q 同一个小鼠的一个基因位点鉴定不出来，其他基因都可以鉴定出来？

A 若同一个样品的DNA模板，其中一个基因位点扩增不出目的条带，其他基因位点都能扩出，说明这个样品可能是个多基因修饰的模型组织DNA。

1、需要确定是否为多基因都修饰成功了。比如亲本是多基因修饰模型，在繁育过程中后代基因会分离和随机组合，不一定同时携带了多个修饰位点；

2、其次，如样品确定是携带多基因修饰的，其他基因能扩出来，证明DNA模板没有问题，可能是以下两个原因：

（1）另一个基因位点的扩增引物不适，比如引物降解了、设计不合理等，如果是之前鉴定过没有问题的引物，那直接安排重新合成即可；若没有扩增过，可以返回查看引物序列是否合理，有问题需重新设计；

（2）该基因序列相对其他基因较复杂，比如高GC、低GC、序列重复等，需要对PCR程序调整，可用touchdown提高扩增效率或梯度摸索最佳退火温度；同时选用其他扩增效率更高的聚合酶；PCR体系中根据序列特殊性增加DMSO、Mg2+等。

Q 如果人源化小鼠的插入位点是未知的，该如何设计引物进行鉴定呢?

A 如果人源化小鼠的插入位点未知，那猜测是个转基因过表达模型。插入的位点未知，但插入的人源化序列是已知的，可以将引物设计在人源化序列上：

1、常规PCR方法只能区分阳性和阴性，无法区分纯杂合；

2、如果是基因组人源化，设计引物时需要考虑人源序列与鼠源序列的同源性，将引物设计在非同源的人源序列区域，并且将设计好的引物在NCBI “Primer-BLAST”分析，在鼠源基因组上没有结合位点，只结合人源序列；

3、如果是人源CDS过表达，有引入外源启动子等调控元件，优先将引物设计在外源元件上，如CAG启动或者polyA上；因此人源化小鼠样品能扩出阳性条带，野生型小鼠无法条带。

Q PCR循环数应该怎么选择呢？

A 根据模板的类型和扩增的目的来区分，且根据实际扩增结果微调，一般规则如下：

1、判断基因型为阳性还是阴性：只需通过跑电泳宏观分析条带大小，一般循环33~38个；

2、扩增的目的条带需要回收用于测序：PCR条带要求亮，产物回收量有要求，循环设置在35~38个；

3、扩增的目的条带需要回收用于质粒克隆：扩增的PCR产物保真性要求高，不能有突变或缺失，因此用高保真聚合酶，循环一般27~30个循环；

4、以小鼠基因组DNA作为模板：基因组扩增相对质粒更难，模板DNA要求在50~100ng，常用的循环数33~38个；

5、以质粒DNA作为模板：扩增简单，质粒DNA拷贝数高，模板要求小于1pg，常用循环数25~30个。

Q PCR条带为150bp以下，电泳条带非常模糊，有什么好的方法吗？

A

1、使用TBE电泳缓冲液，相较于TAE，TBE更合适分离小分子DNA片段；

2、琼脂糖凝胶浓度用3%；

3、只用一排制胶梳子，可用电泳跑道距离足够大，防止染料扩散快导致DNA条带不够亮：DNA带负电，在电泳中的迁移方向是从负极-正极，染料带正电，方向是由正极-负极；

4、电泳时，电压降低，4V/cm，若一个20cm的电泳槽，电压可设置为80V。