哈尔滨医科大学潘振伟团队发现调控NAFLD疾病进程的新型蛋白CAND1

图1 CAND1在NAFLD患者，HFD小鼠和PA诱导的肝细胞中低表达[^[1]

研究人员在NAFLD患者和正常供者的肝活检样本中检测了CAND1的表达水平。与正常供体相比，NAFLD患者肝脏组织中CAND1 mRNA和蛋白质含量降低。与对照组相比，HFD喂养后小鼠肝脏中CAND1 mRNA和蛋白质水平也显著降低。此外，AML12和THLE-2细胞暴露于棕榈酸（PA）24小时后，CAND1 mRNA和蛋白质水平也显著降低，这些结果表明，CAND1在NAFLD的发展中起着合理的作用，如图1所示。

图2 肝细胞特异性CAND1缺乏加剧了雄性小鼠hfd诱导的肝损伤^[1]

为了验证CAND1对肝细胞的特异性作用，研究人员使用赛业生物提供的CAND1^flox/flox小鼠与Alb-cre工具鼠杂交构建了肝细胞特异性CAND1敲除（条件敲除，cKO）雄性小鼠。值得注意的是，在HFD治疗后，WT和CAND1 cKO小鼠的食物摄入量没有统计学差异。HFD处理增加了16周后WT和CAND1 cKO小鼠的体重和附睾脂肪重量，WT-HFD和CAND1 cKO-HFD小鼠的体重和附睾脂肪重量相当。CAND1 cKO-HFD小鼠的LB/BW比增加。与WT-HFD小鼠相比，CAND1 cKO-HFD小鼠的TG和TC水平显著升高。H&E和油红O染色显示，CAND1 cKO-HFD小鼠肝脏中的脂质积累比WT-HFD小鼠更严重。CNAD1 cKO-HFD小鼠表现出更高的空腹血糖、胰岛素浓度和HOMA-IR。此外，与WT-HFD小鼠相比，CAND1 cKO-HFD小鼠表现出更强的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。肝脏炎症是NAFL发展为NASH的常见病理改变。与WT-HFD小鼠相比，CAND1 cKO-HFD小鼠肝脏中促炎因子的表达增加。然而，WT-HFD和CAND1 cKO-HFD小鼠的纤维化面积和血清αFP（肝癌标志物）水平没有差异。这些发现表明肝细胞中CAND1缺乏加重了hfd诱导的肝损伤，如图2所示。

图3 肝细胞特异性CAND1过表达改善雄性小鼠hfd诱导的肝损伤^[1]

研究人员进一步使用赛业生物提供的CAND1^knockin小鼠与Alb-cre工具鼠杂交建立了肝细胞特异性CAND1过表达（条件敲入，cKI）雄性小鼠系，以验证肝细胞CAND1对HFD治疗后肝损伤的功能。HFD或NC治疗后，WT与CAND1 cKI小鼠的进食量无统计学差异。HFD治疗在HFD治疗16周后增加了WT和CAND1 cKI雄性小鼠的体重和附睾脂肪重量，WT-HFD和cKI-HFD小鼠的体重和附睾脂肪重量相当。与CAND1 cKO小鼠的变化相反，肝细胞特异性过表达CAND1在很大程度上保护了HFD诱导的肝脂肪变性、肝抵抗和炎症。具体而言，肝细胞中CAND1的过表达改善了肝脂肪变性，降低了LW/BW比和肝脏中TG和TC的含量。与WT-HFD小鼠相比，CAND1 cKI-HFD小鼠的糖耐量和胰岛素敏感性显著提高。此外，CAND1 cKI-HFD小鼠的促炎因子mRNA水平低于WT-HFD小鼠。天狼星红染色显示WT-HFD和cKI-HFD雄性小鼠的纤维化面积没有差异。这些数据证实了CAND1在hfd诱导的肝损伤中的保护作用，如图3所示。

图4 CAND1控制脂肪酸β-氧化基因ACAA2的泛素化降解^[1]

图5 CAND1抑制Cullin1、FBXO42和ACAA2复合物的形成^[1]

CAND1通过调节含有底物受体的F-box和Cullin1复合物的组装来控制全局CRLs网络的动力学。为了阐明CAND1调控NAFLD发展的机制，研究人员进行了Co-IP和质谱分析，以鉴定转染NC或siCAND1的PA处理的L02细胞中的cullin1结合蛋白。共获得72个解除调控的cullin1结合蛋白，其中39个基因上调，33个基因下调。在上调基因中，乙酰辅酶A酰基转移酶2（ACAA2）和F-box蛋白42（FBXO42）引起了研究人员的注意。ACAA2是一种脂肪酸β氧化的硫解酶，其过表达可促进脂肪酸氧化并抑制脂质积累。F-box蛋白FBXO42是一种底物受体，可招募靶蛋白并促进其泛素化降解。他们推测Cullin1、FBXO42和ACAA2可能形成一个SCF复合物，调节ACAA2的泛素化和降解，从而影响CAND1对NAFLD的作用。分子对接也预测了FBXO42与ACAA2和Cullin1结合。

研究人员检测了Cullin1、FBXO42和ACAA2复合物在AML12和THLE-2细胞中的形成。PA处理后siCAND1中ACAA2、Cullin1和FBXO42复合物的形成较NC组明显增加，PA处理后siCAND1中ACAA2蛋白表达较NC组明显下调。

与WT小鼠相比，WT-hfd小鼠的ACAA2蛋白表达明显降低。与WT-hfd小鼠相比，CAND1 cKO-HFD小鼠的ACAA2蛋白显著降低，表明ACAA2泛素化程度较高。CAND1 cKI-HFD雄性小鼠的ACAA2蛋白显著上调，泛素化水平明显降低。

接下来，研究人员用Co-IP法检测Cullin1、FBXO42和ACAA2复合物。与WT小鼠相比，WT-hfd小鼠中ACAA2、Cullin1和FBXO42复合物的形成明显增加，且CAND1 cKO-HFD中ACAA2、Cullin1和FBXO42复合物的含量高于WT-hfd小鼠。然而，与WT-HFD小鼠相比，CAND1 cKI-HFD小鼠中ACAA2、Cullin1和FBXO42复合物的含量较少。这些结果表明，CAND1抑制ACAA2、Cullin1和FBXO42复合物的组装，从而抑制ACAA2的泛素化降解，如图4，5所示。

图6 ACAA2过表达可改善因CAND1缺陷增强的雄性小鼠肝脂肪变性、胰岛素抵抗和炎症^[1]

为了进一步阐明CAND1对NAFLD的调节作用是否由ACAA2介导，研究人员通过尾静脉向雄性小鼠注射AAV8-ACAA2病毒，特异性提高了ACAA2在肝细胞中的表达。ACAA2过表达大大改善了CAND1 cKO-HFD小鼠的病理改变，包括LB/BW比、肝脏TG和TC水平以及脂质积累。此外，ACAA2过表达显著消除了CAND1条件敲除对饲喂HFD小鼠的空腹血糖、空腹胰岛素和HOMA-IR指数的加重作用。此外，ACAA2过表达改善了CAND1 cKO-HFD小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性，这一点通过腹腔注射GTT和ITT得到了证明。ACAA2过表达也降低了CAND1 cKO-HFD小鼠中促炎因子IL-6、TNF-α和TLR-4的水平。这些结果表明，肝细胞CAND1对NAFLD进展的影响是由ACAA2介导的，如图6所示。

图7 肝细胞特异性CAND1敲除促进雄性小鼠饥饿诱导的脂肪肝^[1]

在禁食条件下，过量的脂肪酸被重新酯化成甘油三酯，在肝脏细胞内储存，从而导致饥饿性脂肪肝。然后，研究人员探讨了CAND1是否也对饥饿诱导的脂肪肝有调节作用。在雄性小鼠饥饿24h后，他们检测了肝脏脂质的积累。结果显示，与WT小鼠相比，CAND1 cKO雄性小鼠饥饿后肝脏脂质积累更为严重。CAND1 cKO雄性小鼠肝脏中TG和TC水平也显著升高。此外，CAND1 cKO中ACAA2水平显著降低。这些数据表明，CAND1也抑制饥饿诱导的肝脏脂质代谢，如图7所示。

图8 雄激素/雄激素受体（AR）信号调控CAND1的转录^[1]

由于NAFLD肝脏中CAND1的mRNA水平降低，他们随后探索了CAND1的转录调控。研究人员使用JASPAR网站预测了CAND1基因的转录因子，并在CAND1基因的启动子区域确定了四个雄激素受体（AR）的潜在结合位点。他们观察到NAFLD雄性小鼠与正常鼠相比睾酮和AR水平下降。PA诱导后AML12细胞中AR表达也下降。有趣的是，与WT雄性小鼠相比，CAND1 cKO雄性小鼠的AR表达和睾酮水平显著降低。

为了阐明AR对CAND1转录的直接影响，研究人员将AR过表达质粒和含有顺序截断的CAND1启动子的质粒共转染到细胞中。在CAND1启动子区域鉴定了四个推测的AR结合位点。这些结合位点的序列缺失表明，ar结合位点1是ar促进CAND1转录活性的主要位点。此外，睾酮处理上调了AML12细胞中CAND1的mRNA和蛋白水平。pa诱导的脂质积累在siCAND1组和siAR组相似。在AML12细胞中，与单独敲低CAND1相比，AR和CAND1的同时敲低加重了PA诱导的脂质积累，而在PA处理后，CAND1的过表达减轻了AR缺陷引起的AML12细胞中的脂质积累。研究人员给雄性小鼠服用AR拮抗剂enzalutamide（10mg/kg），发现CAND1 mRNA和蛋白水平显著降低。并且，小鼠出生后2-6个月肝脏中CAND1水平升高，12个月时下降，这与AR的表达变化一致。这些结果表明，CAND1的转录受雄激素受体的调节，如图8所示。

图9 CAND1在调节ACAA2泛素化和降解中的作用^[1]

在本研究中，作者发现CAND1阻断Cullin1、FBXO42和ACAA2复合物的组装，抑制ACAA2的泛素化降解，从而维持肝细胞内脂肪酸降解的速度，减少肝脏内脂质积累。雄激素受体通过结合-187到-2000启动子区域来决定CAND1的转录。研究结果表明，CAND1是治疗NAFLD的一个潜在的靶点。