IF=31.25丨比利时科学家首次发现单核细胞具备增殖能力

组织驻留巨噬细胞（RTM）是一种分化的免疫细胞，它们占据不同的生态位并发挥着重要的组织支持功能。尽管目前认为RTM生态位的维持是通过单核细胞的分化或成熟RTM的自我更新来实现的，但RTM在稳态下缓慢更替，且缺乏合适的模型，这都阻碍了对RTM动态的研究。

肺间质巨噬细胞（IM）是一种长寿命的组织驻留巨噬细胞，在成人体内由Ly6C⁺经典单核细胞（cMo）缓慢补充，具体包括血管周围CD206⁺ IM和神经相关CD206^- IM，可作为研究单核细胞到RTM轨迹的模型。因此，研究人员在本研究中利用小鼠肺间质巨噬细胞生态位耗竭和再次填充模型来研究间质巨噬细胞在体内的发育。

研究者发现，肺间质巨噬细胞高水平表达跨膜蛋白119的编码基因（Tmem119）和fractalkine受体的编码基因（Cx3cr1）。于是，研究者将Tmem119^Cre小鼠（由赛业生物提供）和Cx3cr1^LSL-DTR小鼠杂交，构建了白喉毒素（DT）诱导的肺IM生态位耗竭的转基因小鼠模型（IM^DTR）。向IM^DTR小鼠的腹腔注射白喉毒素24小时后，CD206⁺ IM和CD206^- IM亚群被有效清空。

与对照组相比，IM^DTR小鼠在处理后第2天和第3天的IM数量仍然很低，但肺部cMo数量显著增加。从第3天起，IM数量逐渐增加，在第7天达到与对照组小鼠相似的水平。同时，IM^DTR小鼠肺部和血清中的单核细胞趋化因子Ccl2含量在处理后显著增加，表明cMo是通过Ccr2依赖性方式被吸引到肺部的。通过一系列实验，研究者证实cMo可在白喉毒素处理后的IM^DTR小鼠中产生分化的CD206⁺ IM和CD206^- IM亚群。

从单核细胞到肺间质巨噬细胞，这中间有着怎样的轨迹？对于分选自IM^DTR小鼠的单核细胞和间质巨噬细胞，研究人员开展了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。研究者总共分析了15,000多个髓系细胞，并鉴定出七个不同的细胞簇（图1）。根据差异表达分析，研究者确定了与不同细胞相对应的细胞簇，包括cMo（C1）、pMo（C2）、CD206^- IM（C3）和CD206⁺ IM（C4），而C6则代表过渡的单核细胞（Tr-Mo）。RNA速率分析也表明，Tr-Mo是从cMo向IM亚群移动（图1f）。这些实验在单细胞转录组水平上捕捉到了从单核细胞到间质巨噬细胞的完整轨迹。

scRNA-seq分析揭示了不同的过渡细胞^[1]

研究人员接着对scRNA-seq数据开展了Monocle单细胞轨迹分析，并发现了两条主要轨迹，都是从cMo开始，穿过Tr-Mo到达分叉点，然后向CD206^- IM或CD206⁺ IM分叉，与实时分析结果一致（图2）。此外，研究者还观察到与细胞增殖相关的基因（比如Ube2c、Aurkb、Racgap1、Cdk1等）出现上调，并与Tr-Mo的S和G2/M细胞周期评分升高相对应，表明存在DNA复制和有丝分裂。通过绘制cMo特征、S期和G2/M期以及IM特征的拟时间图，研究者发现cMo一旦进入空的生态位就会变成Tr-Mo，然后重新进入细胞周期并扩增，最后分化成CD206^- IM或CD206⁺ IM。

间质巨噬细胞发育的轨迹分析鉴定出瞬时增殖的单核细胞^[1]

之后通过EdU标记，研究人员在IM^DTR小鼠体内检测到过渡的单核细胞。EdU⁺CD64⁺细胞代表了在局部增殖的单核细胞，并处于从cMo到分化的IM之间的过渡状态。考虑到Csf1受体（Csf1r）信号通路在调控单核细胞增殖中发挥重要作用，研究者在白喉毒素处理后对IM^DTR小鼠注射Csf1r抗体。在注射抗体后，小鼠中EdU⁺CD64⁺细胞的比例明显下降，表明这些细胞在分化成IM之前通过Csf1r依赖性机制在组织中增殖。

为了深入了解Tr-Mo增殖和IM分化间的平衡受到哪些调控，研究者运用SCENIC算法来绘制基因调控网络图。MafB是CD206⁺ IM中得分最高的转录因子之一，研究者认为MafB的激活可能限制了Tr-Mo增殖，并促进其发育成IM。与cMo相比，增殖单核细胞中的MafB表达减少，而IM中的MafB表达增加。通过构建Mafb髓系条件性敲除小鼠，研究者发现髓系限制性的Mafb缺乏严重影响了cMo重新填充IM亚群生态位的能力（图3）。这些结果说明，单核细胞增殖需要低水平MafB表达，而随后MafB的表达增加会限制增殖并促进其分化为IM。最后，研究者还发现CD206⁺ IM亚群的特征受到转录因子c-Maf调节。

MafB限制增殖并介导间质巨噬细胞发育^[1]

总的来说，研究人员通过一系列研究发现单核细胞能够在空的生态位中以受到MafB限制的方式增殖，然后分化成不同的间质巨噬细胞亚群。研究者创新性地使用了一种肺间质巨噬细胞生态位耗竭和重新填充模型，进而捕捉到在稳态环境下难以获得的结果。这些结果提供了新线索，有助于了解单核细胞增殖与组织驻留巨噬细胞分化之间的复杂调控。