小鼠活体成像在肿瘤研究中的应用有哪些？实验要点有哪些?

常用于肿瘤活体成像的光学标记方法包括：

1、利用萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）或荧光蛋白作为报告基因，通过转基因技术体外标记肿瘤细胞而直接观测肿瘤的发展变化，或标记特定基因而研究肿瘤相关基因在肿瘤发展中的作用；

2、通过外源注射功能性荧光探针，观测肿瘤发展过程中的分子事件，进而反映肿瘤的发展变化。

宏观来说，应用小动物活体光学成像技术进行肿瘤研究主要集中于：1、长时间监测肿瘤生长及转移；2、抗肿瘤药物研发；3、癌症分子机理研究。

除药效学以外，该技术也广泛应用于药物在体内靶向、分布及代谢的研究。此类应用是以药物为直接观测对象，通常是利用荧光探针直接标记药物本身，通过追踪荧光信号而反映药物在体内的分布情况。如研究抗体或多肽类药物能否有效靶向肿瘤时，可利用荧光染料通过化学键的结合标记目标抗体或多肽，利用活体光学成像观测上述标记对象的肿瘤靶向性。

应用活体荧光成像技术进行药物分布的观测目前主要局限于对生物大分子药物的研究，而对天然或化学小分子药物的分布代谢研究主要依靠的是放射性核素标记成像（PET或SPECT），原因是用相对大分子量的荧光染料标记小分子药物，则荧光染料本身即会对小分子药物在体内的分布代谢产生影响，因此无法将活体荧光成像技术应用于此类研究。

小动物活体成像常用的2种技术为生物发光与荧光，其中，生物发光是用荧光素酶基因标记细胞或DNA，利用其产生的蛋白酶与相应的底物荧光素发生反应产生光信号。

生物发光试验荧光素试剂的制备：D-荧光素钠盐，配制成100mM的储存液（200×，浓度30mg/ml），也可以按试验需要量进行配置。将D-Lucirerin溶解于预热好的组织培养基中制备成浓度为150μg/ml的工作液。用组织培养基1:200稀释储存液，配置工作液（终浓度150μg/mL）。

去除培养细胞的培养基。细胞计数，调整细胞浓度至100,000细胞/ml（10,000细胞/100μl）。图像分析前，向细胞培养板中添加1×荧光素工作液，然后进行图像分析。

*提示：成像前在37℃下对细胞进行短时间孵育可增强信号。

生物发光试验荧光素试剂的制备：用无菌PBS配制D-荧光素钾盐工作液（15mg/mL），0.2um滤膜过滤除菌。按10uL/g剂量，给予150mg/kg荧光素工作液（如10g的小鼠注射100μl工作液，给予1.5mg荧光素），腹腔注射荧光素10-15min后进行成像。

腹腔注射：左手保定动物，腹部朝上，将动物的颅（头部）末端朝下。轻轻晃动小鼠2-3次，使肠道中未消化食物向下移动在下腹四分之一部位形成一个空腔。注射点用75%的乙醇消毒。右手持注射器，插入小鼠腹部，注射部位为小鼠后肢根部连线处任一侧1.5cm处，缓慢以45度左右进针，进针深度小于1cm，进针的感受为局部皮肤凹陷消失和落空感。

对于有毛小鼠，建议在成像实验的前一天进行脱毛，从而最大限度地消除毛发的背景荧光和其他干扰。小鼠毛发在短波长激发光下的背景荧光尤为显著，如图1的两只ICR小鼠（白毛），左为已剃毛，右为未剃毛，在465nm光激发下，可以明显看出毛发的背景荧光。一般建议使用小鼠剃毛器，因为脱毛膏含有一些芳香成分，可能会带来背景荧光；且脱毛膏和硫化钠等化学试剂均可能对小鼠皮肤造成灼伤，伤口处有时会伴随着较强的背景荧光。

小鼠在成像前建议先用温水浸湿的纱布搽拭口鼻、爪子以及排尿处，因为这些部位常伴随着不必要的背景荧光。在荧光光谱分离时，有时信号较弱难以识别，可以按照图2进行实验设计，即对照组小鼠、受体小鼠和阳性染料对照。

即材料中含有磷光发光物：问题材料包括塑胶、颜料、有机物、塑料绳和一些塑料容器；一些污染物，包括动物的尿液也可能是磷光源。

即样品的天然发射光，它并不是样品要被检测的信号。细胞培养基可能会产生磷光（材料在使用前，需经过成像扫描，以鉴定和排除有问题的材料），这种自身发射光一直伴随着活体动物（自发生物发光），且存在于体内生物发光成像的主要检测区域。大多数动物表现为较低水平的自发生物发光，通常只有在高灵敏度检测弱信号的时候会存在问题。

背景的近似值（通过检测相似的对照组动物或者从检测小鼠的非检测区域获得）可以从ROI测定中去除。

对于体内的应用，波长范围最好在600nm以上，低于600nm的光很容易被动物组织吸收掉，这将影响光穿透的深度，如几个毫米以上深度的荧光基团就可能不会被激发。另外，低于600nm波长，组织的自发荧光会增加。