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冠状病毒如何通过宿主受体打开细胞之门?

最近,新型冠状病毒疫情一直揪着全国人民的心。从各地分离出毒株开始,到完成测序比对之后,普通民众最关心的是我们的药物和疫苗还要多久才能面世?科研界也在全力投入进行病毒感染机制研究,以期早日“知其然知其所以然”,实现精准防治。

 

冠状病毒刺突糖蛋白(Spike)和受体ACE2是严重急性呼吸道综合症(SARS-CoV)的关键结合位点。由于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)和SARS-CoV的基因序列以及发病状态等方面的相似性,使得科研界再一次将目光投向冠状病毒刺突糖蛋白(Spike)和受体ACE2的研究。对Spike蛋白和宿主受体蛋白的结合位点分析意义重大,可以让我们更清楚的了解该病毒的入侵方式,受体的作用机制,为当前的新冠病毒入侵提供策略,为以后可能发生的冠状病毒的防治铺开道路。

 

冠状病毒刺突糖蛋白(CoV Spike)蛋白结构域分析

 

第一个要讲的是冠状病毒的Spike蛋白(S)。冠状病毒的S蛋白分为S1和S2结构域。S蛋白介导受体与病毒蛋白膜之间的融合方式通常是这样的:

 

•S1负责与受体结合。S1结构域的N末端与C末端均可与宿主受体结合。

 

•S2负责与宿主细胞膜融合。冠状病毒S2含有多个关键分子,包括多个融合肽和两个保守肽重复序列(HRs),来驱动病毒与宿主细胞之间的融合。HRs可以三聚成卷曲结构,将病毒包膜和宿主细胞双层紧密靠近,为融合的发生做准备。

 

CoV Spike蛋白结构

图1. CoV Spike蛋白结构示意图

 

尽管SARS-CoV-2和SARS-CoV属于不同种的菌株,但它们在用于鉴别的S1保守域中仍有约50个保守氨基酸保持一致,这说明SARS-CoV-2和SARS-CoV的结构相似,且二者同属于β冠状病毒,而β冠状病毒的受体结合域通常位于S1的C末端,如图2所示。由此我们可以猜测,SARS-CoV-2的宿主受体是否和SARS-CoV的宿主受体相同?

 

系统发育分析和SARS-CoV-2,SARS-CoV和MERS-CoV的受体结合域

图2. 系统发育分析和SARS-CoV-2,SARS-CoV和MERS-CoV的受体结合域(引自Roujian Lu 2020)

图A. 各种β冠状病毒的受体结合结构域的系统发育分析。

图B、C、D:SARS-CoV,SARS-CoV-2和MERS-CoV结合其宿主受体结构域的比较。核心结构用品红表示,SARS-CoV,SARS-CoV-2和MERS CoV的外部子域分别是橙色,深蓝色和绿色。受体结合位点中SARS-CoV和SARS-CoV-2之间的可变残基突出显示为棒状。图C SARS-CoV-2,❓表示新型冠状病毒使用的受体仍然未知。(自2020年2月11日国际病毒分会为新冠病毒提供新的命名之后,本文均用SARS-CoV-2代替2019-nCoV。)

 

研究发现,SARS-CoV要进入受体,首先要通过病毒RBD(receptor binding domain)与细胞表面受体ACE2结合。那么SARS-CoV-2的S蛋白与人ACE2受体是否具有亲和性呢?根据前期研究发现,使用HeLa细胞表达的ACE2可以作为SARS-CoV-2的受体,但是如何结合还有待进一步研究。下面我们就来浅谈一下ACE2蛋白的结构。

 

ACE2受体蛋白结构分析

 

ACE2是一种I型跨膜糖蛋白,包含一个由两个α螺旋构成的N端胞外域。病毒受体结合域RBD利用其外部结构域与受体的N末端结合。如图3所示。RBD凹表面有424-494残基,也称为受体结合基序(Receptor binding motif RBM),形成ACE2的N端螺旋与受体进行接触,所组成的复合物形成SARS-CoV RBD 927.8A˚2和ACE2 884.7A˚2的界面,该界面包含受体中的至少18个残基和RBD中的14个残基,形成了一个在RBD/ACE2相互作用中占主导地位的亲水性接触网络。在与ACE2结合后,SARS-CoV包膜与宿主细胞膜之间的融合由S2亚基完成。

 

SARS-CoV受体ACE2结构

图3. SARS-CoV及其受体ACE2结构示意图

(参考Guangwen Lu 2015)

绿色:RBD核心;品红:RBD核外域;青色:ACE2 N末端;橙色:ACE2 C末端

 

SARS-CoV-2与SARS-CoV二者的序列具有79%的相似性,同时我们发现SARS-CoV-2 RBD序列,包括其RBM直接接触ACE2的途径也与SARS-CoV相似,于是研究者就猜测ACE2受体很可能是SARS-CoV-2感染人体的关键受体蛋白。

 

如图4所示,与SARS-CoV相比,SARS-CoV-2 受体结合基序(RBM)除了在远离ACE2结合区环上插入了一个残基之外不包含任何删除和插入序列。

 

SARS-CoV和SARS-CoV-2对ACE2识别的结构分析

图4. SARS-CoV和SARS-CoV-2对ACE2识别的结构分析(参考Yushun Wan 2020)

A. 实验确定SARS-CoV RBD和人类ACE2之间的界面结构,SARS-CoV RBD上的五个残基均经过自然选择,并显示出对ACE2的识别以及进入宿主细胞至关重要。

B. SARS-CoV-2 RBD与人ACE2之间的界面建模结构。根据SARS-CoV与SARS-CoV-2之间的序列关联,对应出相应的残基编号。

 

在与ACE2接触的病毒受体结合域的14个残基中,SARS-CoV-2和SARS-CoV中有9个是完全保守的,有4个是部分保守的,下面我们就来分析这些残基。

 

SARS-CoV病毒受体结合域中的残基479位于人ACE2上的病毒结合位点Lys31(即hotspot-31)附近。Hotspot-31由埋在疏水环境中的Lys31和Glu35之间的盐桥组成。K479N突变消除了RBD与人类ACE2界面的不利作用,增强了病毒与ACE2的结合,并使SARS-CoV从人到人的传播中发挥了关键作用。重要的是,SARS-CoV-2 RBD中的Gln493与hotspot-31兼容,这表明SARS-CoV-2能够识别人ACE2并感染人类细胞。

 

而SARS-CoV-2 RBD中的501残基(对应于SARS-CoV中的487残基)是天冬酰胺。根据研究者之前的结构分析,SARS-CoV中的487残基位于人ACE2上的病毒结合位点Lys353(即hotspot-353)附近。 Hotspot-353由Lys353和Asp38之间的盐桥组成,该盐桥也被埋在疏水环境中。在2002年分离出的人SARS-CoV中,487残基是苏氨酸,可增强353号热点的结构稳定性。S487T突变增加了RBD 与人类ACE2界面的相互作用,增强了病毒与人类ACE2的结合,并在人与人之间传播SARS-CoV的过程中发挥了关键作用。

 

455、486和494残基在SARS-CoV-2 RBD中分别为亮氨酸,苯丙氨酸和丝氨酸,分别对应于SARS-CoV中的442、472和480残基。研究者发现,SARS-CoV RBD中的这三个残基在ACE2结合中起着重要作用,尽管不如残基479和487剧烈。

 

尽管存在氨基酸残基的替换,但SARS-CoV-2的S蛋白与人ACE2受体仍然具有显著的结合亲和力。也就是说,hotspot-31和hotspot-353或许就是我们要研究的重要位点。但是由于小鼠或大鼠ACE2的353位含有一个组氨酸,它并不像赖氨酸那样适合病毒与受体之间的相互作用,这对于中间宿主的筛选也提供了一项证明。

 

不同物种ACE2与SARS-CoV RBD的结合

表1. 不同物种ACE2与SARS-CoV RBD的结合(引用Fang Li 2016)

 

与SARS-CoV和MERS-CoV一样,SARS-CoV-2也是人畜共患病原体,可越过物种间的壁垒感染人类。病毒种间传播的机制是一个亟需解决的重要科学问题。这些冠状病毒的胞膜蛋白和受体识别并发生细胞融合,而Spike蛋白在与膜发生融合之前需要被宿主蛋白切割,这个过程也是病毒在感染宿主时的必经过程,因此,若是将其阻断,即可阻止了病毒的感染性。

 

结语

 

本文详细表述了Spike蛋白和细胞膜受体蛋白ACE2的结构以及作用方式,结合之前关于SARS-CoV的相关研究对SARS-CoV-2进行分析,最终落脚到受体蛋白上的两个结合热点区,然而要验证这些位点与临床表现的关系,必须回到体内进行研究,以基因修饰小鼠模型为研究工具,进行更精细化更贴近临床的研究,这或许对疫苗及药物的研发有着重要的指导意义。当然,这里没有探讨同样是冠状病毒的MERS-CoV结合域及其受体CD26,如果感兴趣,我们期待着能给研究者们带来更多的精彩解读。

 

病毒研究道阻且长,希望在人类与微生物的抗战中,我们能走在前面,站在高处,更透彻的了解对手,人类文明因为有科学技术的不断探索而变得更加神秘而多彩。

 

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参考文献:

1. Roujian Lu, Xiang Zhao, Juan Li, Peihua Niu, Bo Yang, Honglong Wu et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. The lancet. 2020.

2. Guangwen Lu, Qihui Wang, George F. Gao. Bat-to-human: spike features determing host jump of coronaviruses SARS-CoV, MERS-CoV, and beyond. Cell press. 2015.

3. Fang Li. Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins. Annual review of virology. 2016.

4. Yushun Wan, Jian Shang et al. Receptor recognition by novel coronavirus from Wuhan: An analysis based on decade-long structural studies of SARS. Journal of virology. 2020.

5. Fang Li et al. Structure of SARS coronavirus spike receptor-binding domain complexed with receptor. Science. 2016.

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