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《鼠年说鼠》第十期:如何提取组织DNA模板?


    

《鼠年说鼠》系列文章,每周二更新,专门解答大小鼠铲屎官们在养鼠过程中经常遇到的繁育与鉴定类的问题,同时向大家征集问题,任何基因编辑鼠饲养繁殖或鉴定的困惑统统可以丢给小赛,小赛会给您回复或统一在后面的内容为大家做出详细的解答。今天我们开始进入鉴定篇~

 

《鼠年说鼠》第十期:如何提取组织DNA模板?

 

鉴定基因编辑鼠剪爪、剪尾组织量是多少?

根据实验经验,剪爪、剪尾应在出生后 7—12 天内完成,这样一方面既可避免母鼠吃仔,另一方面该时段的大小鼠容易抓取、出血较少,提取的基因组质量较高。

1.鼠尾尾尖(<5mm)可获得足够量DNA用于基因型鉴定。

2.AAALAC要求断趾法,最好用于小于7日龄的新生鼠,断趾操作剪取的鼠爪量为鼠爪趾尖组织1-2mm。

 

如何提取组织DNA模板?

 

方法一:

使用 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction kit (Ver.5.0_Code No. 9765) 来提取鼠尾基因组DNA。

 

准备工作:

1.备好无水乙醇。

2.WB使用前需要加入65mL的无水乙醇(试剂盒推荐56mL,我们经过长期数据显示,加入65mL提取的基因组纯度更高)。

3.Buffer GL若出现沉淀,请于56℃加热溶解,待恢复至室温后使用。

4.洗脱膜上的DNA时,用0.25X TE buffer洗脱的DNA保存时间更持久;使用前放置56℃预热,DNA洗脱效率更高。

 

实验流程:

1.每个装有样品的EP管中加 180μL Buffer GL, 20μL 蛋白酶K(用试剂盒里的蛋白酶K加20μL 即可,该浓度是20mg/mL),10μL RNA酶。(注意:鼠尾不能太长,一般2~5mm;如果鼠尾实在过粗,可以增大裂解体系至300μL)。

2.放置56℃ 烘箱过夜反应(一般12~16个小时)。

3.第二天早上从烘箱取出样品放置离心机里,12000rpm离心2分钟,将毛发杂质离到管底。

4.吸取上清至另一干净的EP管中(注意尽量不要吸到管底的毛发和杂质),再加入200μL Buffer GB 和 200μL的无水乙醇,盖好盖子后上下颠倒混匀。

5.混匀后将液体转移至准备好的吸附柱中,12000rpm离心2分钟;弃滤液。

6.向吸附柱中加入500μL Buffer WA,12000rpm离心1分钟;弃滤液。

7.吸附柱的管壁四周加入700μL Buffer WB ,静置1分钟,再12000rpm离心1分钟;弃滤液;(注意:一定要保证WB中已经加过了指定体积的无水乙醇;沿着吸附柱管壁四周加入WB,有助于完全冲洗沾附管壁上的盐份。)

8.重复操作步骤7,弃滤液.

9.空甩: 12000rpm 离心2分钟。

10.将吸附柱放置在一个新的1.5mL的离心管上,盖子开着,室温放置10分钟,以去除残留的乙醇;(注意:乙醇残留会抑制聚合酶扩增)。

11.向吸附柱膜的中央加入50μL 预热过的0.25X TE buffer,盖好盖子后室温静置10分钟;(注意:预热的灭菌水可以提高洗脱效率)。

12.12000rpm 离心2分钟洗脱DNA;可以将离下的液体再次加入膜中央,再静置5分钟,再12000rpm 离心2分钟,获得浓度更高的DNA。

13.将获得DNA测浓度,也可以通过电泳观察纯度。

 

方法二:

使用粗裂的方法获得鼠尾基因组DNA(适用于扩增<1kb的条带)。

 

Triton裂解液的配制:(1L量)

 

1)分别用电子天平称取下列物品至烧杯:

KCl:3.7g

Tris:1.2g

2)加入300~400mL灭菌水溶解。

3)加入1mL TritonX-100,充分溶解,若不能充分溶解可以放入56℃烘箱中溶解。(TritonX-100呈油状液体,注意吸取前先润洗移液器,注意打尽TritonX-100后才能把枪头伸到溶液中反复吹吸,否则很容易使得TritonX-100大量残留在枪头内壁上)。

4)加入80μL浓盐酸调pH至9.0。

5)然后用灭菌水定容至1L后,室温保存,待用。

注意:TritonX-100高压灭菌后会产生大量沉淀,请勿高压灭菌。

 

样品的裂解:

1)取鼠尾或者鼠爪(~2mm)至EP管,加入98μL裂解液+2μL 20mg/mL的蛋白酶K(注:鼠尾不可超过3mm,不然裂解不充分,若鼠尾过粗,可以适量增加裂解液的量;蛋白酶K需要注意不要反复冻融,不然会影响活性)。

2)加了裂解液和蛋白酶K后,将EP管放入56℃烘箱或者水浴锅,过夜运行;

第二天从烘箱中取出样品,放置金属浴或者PCR仪中,98℃反应15分钟,目的是使蛋白酶K失活。

3)之后将样品离心15分钟,上清即可作为PCR模板。(一般25μL的PCR体系中,可以加入1.5μL的上清)。

 

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