阿尔茨海默症行为学“金标准”— 水迷宫之流程篇

在介绍实验流程之前，我们需要了解水迷宫实验的两大要素，驱动力和考核内容。水迷宫的驱动力是小鼠本能对水环境的厌恶，这就驱使小鼠想要尽快逃离这个环境，其中略低于水面的平台就可以让小鼠基本达成逃离水环境的目标。因此小鼠有动力尽快找到这个平台；而考核内容则是分析小鼠是不是能够尽快学会用周围的提示物（Cues）为线索找到水下平台。绝大部分水迷宫实验主要包括（但不限于）以下三个部分：

（1）平台可见期实验（2 days）；

（2）平台隐藏期训练（5 days）；

（3）无平台期检测（1 day）。

图1. 标准水迷宫实验日期表（不含适应环境期）

下面我们就来详细介绍以下这种标准水迷宫实验的流程:

小鼠对实验环境的适应

有条件的话小鼠应该在正式实验前1周移入水迷宫实验房间进行饲养。如果没有这样的条件，也应该尽量将小鼠至少连续三天每天移入水迷宫房间2-4小时，适应实验环境。同时实验人员也应该在实验前与小鼠有连续5天以上，每天2min的熟悉过程。

PS：相对新物体识别和自主交替实验，逃生欲望算是一个比较强的动力，所以水迷宫中适应环境并没有刚才说的两个实验那么关键，但为了增加实验的可靠性，让小鼠熟悉饲养环境和实验人员仍然是必不可少的。

平台可见期实验（“体检”期）

（1）按照前文所述的方法搭建水迷宫实验设施，个人倾向于Cue放在水池内部，因为水池内部的Cue更容易被小鼠看到。

（2）将水池分为四个象限，分别用N，S，W，E命名，此外再设定8个放小鼠下水的方位，从9点钟的1号位置开始逆时针到10点钟位置的8号位，当然这种位置的序号是可以自定义的。

（3）每天每只小鼠进行4次实验，前两次和后两次平台分别放在两个不同的位置，如图2所示，放小鼠的位置在平台所在象限对面象限的两侧位置，例如平台如果在N位置，放置小鼠的位置就在2和4。

（4）放置小鼠时小鼠面朝水池壁，下水轻柔，不要让小鼠呛水（这个步骤在无论是在平台隐藏期还是Probe时期都是一样的）。

（5）小鼠在水中自由探索1分钟，超过1分钟未找到平台，则引导小鼠到平台并让小鼠在平台上停留15s（这个步骤在平台隐藏期是一样的）。

（6）将小鼠擦干，防止热量损失过多，有条件的话擦干后的小鼠放在31-33度左右的鼠笼中进行“烘烤”一分钟左右再放入临时笼中（不要放入长期饲养用的笼子里）。

（7）清理水池表面的粪便（可以连续2-4只小鼠实验后清理，在水迷宫实验中少量粪便影响不大）。

（8）每只小鼠两次下水的时间间隔不少于20min（因为涉及更换平台方位，所以每次都将所有实验用的小鼠完成试验后再开始下一轮比较好）。

（9）平台可见的实验有时1天以内就可以检测到小鼠运动和视力是否有明显问题，所以根据实验情况，有时也只需要一天时间。

图2. 平台可见期实验方案

平台隐藏期实验（训练期）

（1）平台高度低于水平面0.5cm-1cm左右，在所有隐藏平台期内的平台位置固定，为了方便描述，我们将平台的位置设定为E。

（2）将小鼠面朝水池壁轻轻放入水中。每天针对每只小鼠的四次实验，小鼠都是从2，3，8，7这几个位置随机放入（其实是伪随机，每天四个位置都要用到，只是顺序可以随机），图3中就是伪随机的实验方案示意图。

（3）其余步骤和平台可见期的步骤（3）—（8）相同。

（4）记录全部过程影像资料以便分析。

图3. 平台隐藏期实验方案

无平台探索期实验（测试期）

平台隐藏期实验完成后一段时间（具体时间间隔根据实验目的决定），撤去平台，将小鼠从1号位放入（平台隐藏期一直没有用到的离目标平台最远的位置），记录小鼠运动过程以便后来分析。

图4. 无平台探索期实验方案

反转记忆实验（Spatial Reversal）

这个阶段并非必须，但是有些基因的改变或者药物的处理并不会使小鼠在常规的水迷宫学习阶段或者探索实验阶段出现明显的差异，而主要是影响小鼠记忆的灵活性和对固有认知根据现实情况进行调整的能力，反转试验就是应用在这种更为精细的学习记忆能力的差异研究之中，对基因的功能和药效进行细致的检测。

可调整参数及注意事项

水迷宫动物操作的四个阶段中，可以调整的参数不少，而且这些参数的调整，很大程度上也影响着实验结果。下面我们来看看每个阶段可调整因素对实验结果的影响吧。

首先是我们从宏观上看，适应期和平台可见期的实验都不是必须的，更有甚者在论文中连无平台探索期的实验结果也没有展示。实际上，只有平台隐藏期的实验也能够对小鼠的学习记忆能力起到一定的检测作用。但是个人非常不推荐这么做，首先这样会少了很多对照实验的数据，而且这些实验中获得的运动能力和视力的对照数据本身也是非常有意义的；其次这样文章中也会少了不少论据，而且大多数杂志是不接受这种极简版的实验结果的。还有就是如果没有Probe期实验，很难排除一些采用非空间记忆方式完成水迷宫任务的小鼠，比如有的小鼠会采取保持与水池边缘一定距离绕圈的策略。

另外实验人员与小鼠熟悉的过程非常重要，而且小鼠本身就容易焦虑或者抑郁，如果没有让小鼠放下戒心，影响的就不止是小鼠的学习记忆能力了。

另外就是可见平台期前也可以进行一次水池适应实验（60分钟），就是将小鼠放入水池中热一下身，但不是必须的。

关于可见平台期的试验，首先是这个实验的持续时间可以是1天或者1天以上，但是不宜过多；还有就是这个实验可以放在实验的最开始阶段，也可以放在Probe实验之后，甚至在隐藏平台期中也可以插入一天进行。一般而言，如果动物年龄比较大或者水迷宫前有伤害性操作（手术和药物），需要将可见平台实验放在隐藏平台实验之前，提前确认运动能力和视力，防止体弱小鼠在漫长的隐藏平台期实验中死亡。

平台隐藏期是最重要的实验阶段，并且一般而言，这个阶段的实验耗时最长（4-7天最为常见），如果发现小鼠已经基本达到寻找平台的时间极限之后就可以不用继续了，这个极限的时间一般是小鼠寻找平台的平均时间，接近15s左右。

此外，在基础的水迷宫实验基础上，还可以通过延长Probe实验的次数，研究动物对原有平台位置记忆的消退时间。不过，对平台位置记忆的消退时间有两种解读方式，如果对小鼠经过多次Probe实验还“冥顽不灵”，花大量时间坚守在原平台所在象限进行寻找，我们就一方面可以说小鼠的记忆持续时间很久，另一方面也可以认为小鼠的记忆可重塑性较弱。

如果我们在Probe实验之后，马上开始另一次隐藏平台的实验，而这次隐藏平台实验的平台位置与第一次隐藏平台时不同，那么在这个试验过程中检测的就是小鼠的二次学习能力，又叫反向训练。你可以理解为将原有的过时的位置信息进行修正，找到新的标志物与平台位置的联系。这种方法一般用于对更轻微的神经损伤进行检测。同时在第二次隐藏平台的训练过程之后，还可以进行Probe实验。

小结

相比于大多数学习记忆相关的行为学实验，水迷宫有如下优点：

1. 驱动力强，小鼠不喜欢水泡的状态，希望尽快摆脱，因此小鼠会使出浑身解数逃离。

2. 其他实验中存在的气味作为线索的因素基本消失，小鼠随时排泄排便，极易在行为学设备中留下气味。这些气味会干扰下一只小鼠的实验状态并影响实验结果，而这些都在大量水的稀释下趋近于最低。

3. 训练阶段和实验阶段可以获得大量小鼠的行为数据，如找到平台的时间、路程、策略，小鼠不同阶段速度和运动轨迹的比较等等，从而对小鼠的行为进行更精确的分析。

4. 相对禁食对老年小鼠健康的影响，电击造成年轻小鼠的精神创伤而言，伤害要小一些。

5. 非条件反射实验，省去了部分学习时间。

当然水迷宫也不是毫无缺点，相比于新物体识别和巴恩斯迷宫，水迷宫对小鼠的刺激还是比较强的，年老或者疾病小鼠在实验中死去的情况并不罕见。

总而言之，水迷宫实验对空间记忆和参考记忆的检测是相当灵敏且有效的，不过，其环境搭建要求比较严格，实验过程中需要有严格的对照数据分析排除非学习记忆因素对实验结果的干扰，对实验操作员有很高的要求，除了需要详细了解原理之外，实际操作经验也是相当重要的。

好了，关于水迷宫实验部分就介绍到这里，下一期我们将介绍水迷宫实验中所获取主要数据的分析方法。

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参考文献：

1. Erik D. Roberson. Alzheimer's Disease and Frontotemporal Dementia[M]. Humana Press, 2011.

2. Vorhees C V, Williams MT. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nat Protoc. (2006) 1:848–58. doi: 10.1038/nprot.2006.116.