CRISPR-Cas技术及其在肿瘤研究中的应用

CRISPR的前世今生

1987年，日本科学家在研究大肠杆菌的时候发现其基因组上存在一些看起来“奇怪”的重复结构：有一段29碱基的序列反复出现了5次，且两两之间被32个碱基形成的序列隔开了！但这个发现在当时并没有引起科学界的很大关注，毕竟在自然界的生物体内，各种奇奇怪怪的发现实在太多。然后仅仅几年后，1993年西班牙科学家弗朗西斯科莫西卡在另外一种细菌——地中海噬盐菌中又一次发现了这种奇特的重复序列，这引起了莫西卡的兴趣，于是莫西卡在其他细菌中继续寻找，到2000年，莫西卡竟然在超过20种不同微生物体内发现这种重复DNA结构，从此这种重复序列就有了其学术大名：成簇的规律间隔的短回文重复序列（Clustered Regulation Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）。

对于任何有机生命体来说，保存、复制和传递遗传物质都是一件非常精细、困难也很占用资源的事情，因此在这么多不同的物种中都保留了这么一长串的CRISPR序列，必定有其重要的用处。随后，科学家通过对比多种细菌的几千段CRIPSR序列后发现，在CRIPSR序列中存在许多片段与病毒的基因组序列高度一致，虽然不是完整的病毒基因组序列，但这些序列被夹在一段细菌精心设计的重复序列中，进一步的研究证实，这些与病毒基因组高度一致的序列来自于“噬菌体”——一类可以感染和侵袭细菌的病毒，这不禁让人联想到细菌会不会是靠对CRISPR序列的“记忆”来发挥其对噬菌体的免疫。2007年，一群在杜邦公司旗下的丹尼斯克食品配料公司工作的科学家在嗜热链球菌中证明了CRISPR序列对于细菌免疫系统的功能，自此，CRISPR技术才开始走进科学家的视野。

2013年，Jennifer Doudna、哈佛大学医学院的George Church和麻省理工大学博德研究所的张锋分别带领3个研究团队相继证明了CRISPR序列与Cas蛋白结合可以在人类细胞中高效地定位、剪切和修改基因组。2014年，美国专利与商标局将CRISPR-Cas技术相关的第一个专利授予给张锋所在的博德研究所，并将张锋作为专利的第一发明人，这也开启了张锋和Jennifer Doudna漫长的专利之争。2019年，张锋团队在Nature communications发表论文，称开发了第三种基因编辑工具CRISPR-Cas12b，并能在哺乳动物和人体中进行有效的基因编辑，同年8月，瑞士苏黎世联邦理工学院（ETH）的研究团队实现了同时对细胞内25个基因靶点进行编辑，为CRISPR-Cas技术带来了革命性突破。

认识CRISPR-Cas

基因编辑技术是对细胞中的DNA序列进行精准操作从而改变细胞命运和生物体特征的技术，该技术为提高人类对于遗传学的理解以及遗传疾病的治疗提供了重要的工具。CRISPR/Cas系统主要由Cas蛋白和单链向导RNA（sgRNA）所组成，其中Cas蛋白起切割DNA双链的作用，sgRNA起向导的作用，在sgRNA的向导下通过碱基互补配对原则Cas蛋白可对不同的靶部位进行切割，实现DNA的双链断裂（如下图）。CRISPR-Cas是继锌指核酸内切酶（ZFN）和类转录激活因子效应核酸酶（TALEN）之后出现的第3代基因编辑技术，与ZFNs和TALENs的Fok I酶只有在二聚化才具有切割活性不同的是，Cas在sgRNA的引导下以单体蛋白的形式就可发挥功能，从而避免了复杂的蛋白设计或组装的需要。CRISPR-Cas的编辑效率和精确性相比于ZFN和TALEN有了显著提高，其应用领域也开始从遗传性疾病扩展到更多复杂的疾病，目前，CRISPR-Cas技术已经被用于操纵培养细胞和原代细胞、编辑动物和植物的基因组，极大地加快了基础研究的步伐。

CRISPR系统要实现sgRNA和Cas蛋白的递送，通常可从DNA水平、RNA水平和蛋白水平进行递送，即递送含编码Cas蛋白和sgRNA的质粒、递送sgRNA和编码Csa9蛋白的mRNA，直接递送sgRNA和Cas蛋白。其中从DNA水平递送编码Cas蛋白和sgRNA质粒的方式有病毒法、电转法和脂质体法，其中病毒法具有操作简单、成本低和稳定性高的特点，是目前较为常用的一种方式，但也存在脱靶率较高和基因整合的风险。而从RNA水平的递送则是将编码Cas蛋白的mRNA和sgRNA递送到细胞质，在核糖体的作用下翻译成蛋白质，由于mRNA在体内或体外均容易降解，此方式需要采用合适的方法保护mRNA不受降解。而递送Cas蛋白和sgRNA则最为直接简便，由于不用经历转录和翻译过程，使得编辑过程更加快速高效，且脱靶率更低，但此方法的难点在于递送载体的选择和构建，开发新型载体如脂质体、金纳米颗粒、阳离子聚合物等对于此方法的广泛应用十分重要。

病毒载体和蛋白-RNA复合物电穿孔是目前CRISPR常见的两种递送方式，其中体外研究较受欢迎的运输方式是将Cas组装进蛋白-RNA（核糖蛋白复合物，RNP）复合物然后使用电穿孔进行运输，而体内运输释放过程具有更大的挑战性，一般会采用病毒载体进行运输。病毒载体包括慢病毒（LV）、腺病毒（AdV）以及腺相关病毒（AAV），相比于其他载体，病毒载体在运输效率以及组织特异性方面具有很大优势。近几年，由于AAV载体特有的优势，如具有组织特异性以及较低的免疫原性，使其在应用于基因治疗产品开发上表现出了极大的潜力。电穿孔法则是体外细胞基因编辑元件运输的主要方式，通过高压电流脉冲细胞，在细胞膜上产生瞬间的纳米级孔隙，从而允许RNP进入细胞，几乎所有类型的细胞，一旦确定了电穿孔条件，都可以实现较高效率的瞬时和稳定转染，但高压脉冲引起大量细胞死亡和仅部分成功的膜修复，与化学转染方法相比需要使用更大量的细胞。

CRISPR-Cas在肿瘤研究中的应用

目前CRISPR-Cas技术主要用于细胞和动物水平的模型建立，而在肿瘤研究领域，已有多种基于CRISPR-Cas系统的肿瘤细胞和动物模型被成功建立，并用于肿瘤基因、药物靶点和耐药性等方面的临床前验证。

1. 在体内动物模型的应用

癌症动物模型的建立是研究癌症相关基因功能的一个重要手段，CRISPR/Cas技术极大地简化了癌症动物模型的建立，降低了成本又加快了建模周期。目前，采用CRISPR/Cas建立的肿瘤动物模型最常用的为小鼠，其次为大鼠、猪等。例如张峰团队通过CRISPR/Cas技术成功地构建了小鼠肝癌和肺癌模型，他们首先利用Cre-loxP系统将Cas基因敲入小鼠体内，构建Cas小鼠模型后，将筛选出来的3个基因：KRAS、p53和LKB1基因的sgRNA分别转导入小鼠体内，模型鼠发展出了肉眼可见的肺腺癌病理表征，从而证明了KRAS、p53和LKB1基因在肺腺癌发生发展过程中的作用[1]。赛业生物采用基于传统CRISPR/Cas升级而成的CRISPR-Pro技术已经为数千位科研人员成功构建了肿瘤研究相关的基因编辑小鼠和大鼠模型，且研究成果在Nature Communication、Leukemia等顶尖期刊发表。

2. 在体外细胞模型的应用

对于发病机制并不明确的癌症，通过CRISPR/Cas技术可研究特定基因在肿瘤发生和进展过程中的作用。目前采用CRISP/Cas技术建立的肿瘤模型有肺癌、乳腺癌和急性髓细胞白血病细胞系等，例如有研究者采用CRISPR/Cas技术实现沉默骨肉瘤细胞系KHOS和U-2OS中CDK11基因表达，发现CDK11基因沉默后骨肉瘤增殖和侵袭能力显著减弱[2]。慢性髓系白血病的发生常与体内抑癌基因ASXL1的突变有关，并且影响患者的预后。另外有研究者利用CRISPR/Cas技术靶向修复了KBM5细胞中ASXL1的无效突变，显著降低了KBM5细胞的增殖速率，增强了细胞的分化，并且经过ASXL1基因修复的荷瘤小鼠的生存时间较未经ASXL1修复的荷瘤小鼠生存时间长。另外，剑桥大学等多个研究机构的科研人员对来自30种不同恶性肿瘤的324种肿瘤细胞系进行了基因组规模的CRISPR/Cas筛选，发开了名为Project Score的数据库，从而为寻找肿瘤的作用靶点提供帮助。赛业生物提供的细胞基因编辑服务已经在198种肿瘤细胞上成功构建了基因敲除、基因敲入的细胞模型，例如采用CRISPR-Pro技术进行细胞基因敲除可实现大片段的基因敲除，相比于常规的移码突变敲除得更加彻底。

CRISPR/Cas技术在未来肿瘤研究及治疗方面的发展潜力是无限的，但是我们必须清醒地认识到，这项技术还存在很多尚未解决的问题，比如脱靶效应，应用于人体时的伦理问题、安全性问题等。但可以预见的是，随着CRISPR/Cas技术的不断创新最终会解决上述难题，为肿瘤的治疗研究提供新的思路和方向，为肿瘤患者带去新希望。

赛业生物长期致力于大小鼠基因编辑和细胞基因编辑领域，拥有经验丰富的专家团队和成熟稳定的技术平台。

细胞基因编辑平台：

细胞基因编辑基于传统CRISPR/Cas升级而成的CRISPR-Pro技术，采用电转方式进行转染，双gRNA同时打靶，可实现更彻底的大片段基因敲除、基因敲入和精准点突变，与移码突变相比，敲除更彻底，各项实验数据表明采用CRISPR-Pro技术更高效。

动物基因编辑平台：

除了CRISPR-Pro技术以外，赛业生物模式动物一站式服务平台还有alphaknockout基因打靶专家系统、ES打靶技术，实现了模型建立的高效、稳定和数据可靠性，提供的动物基因编辑服务涵盖了药筛评价小鼠模型、定制动物模型、定制模型下游服务和无菌鼠技术平台等，可以满足大部分客户的科研需求。

关于赛业

赛业生物历经15年发展，已服务全球数万名科学家，产品和技术已直接应用于包括CNS（Cell，Nature, Science）三大期刊在内的4300余篇学术论文。除了提供基因敲除、基因敲入、条件性基因敲除模型定制服务外，赛业生物还有专业的手术疾病模型团队，可以提供多种复杂精细的小动物手术疾病模型；药物筛选评价小鼠平台可以提供从欧美行业领袖引进的免疫缺陷鼠、用于心血管及阿尔茨海默症等研究的人源化小鼠；国际标准化无菌鼠技术平台可以提供无菌鼠、无菌动物定制服务、微生物菌群移植服务等基于无菌动物模型的各类产品和服务，结合赛业生物成熟稳定的基因编辑小鼠平台，还可帮助您研究菌群与基因的互作机制。