【每周一鼠】Vkorc1基因敲除小鼠与华法林抵抗

赛业生物《每周一鼠》栏目，每周五更新，为大家讲解一个小鼠模型的故事，希望对大家了解不同的疾病小鼠模型有所帮助。今天和大家见面的是Vkorc1基因敲除小鼠。

Vkorc1基因

作为辅酶， 维生素K在许多维生素K依赖蛋白中特定谷氨酸残基的羧化作用中至关重要。羧化由谷氨酰胺羧化酶（GGCX）催化，其利用还原型维生素K，即维生素K对苯二酚 （KH2）作为辅助因子。伴随着维生素K依赖蛋白中每个谷氨酸残基的羧化，KH2被氧化成维生素K2,3-环氧化物（KO）。KO再经过维生素K环氧化物还原酶（VKOR）和维生素K还原酶（VKR）的作用，还原为KH2，整个过程称为VK循环。

图1. VK循环

维生素K环氧化物还原酶复合物1（VKORC1）基因编码维生素K环氧化物还原酶的重要亚基，负责在内质网膜中将非活性维生素K 2,3-环氧化物还原为活性维生素K。凝血因子II、VII、IX、X需经过γ-羧化后才能具有生物活性，而这一过程需要维生素K参与。华法林是一种双香豆素衍生物，通过抑制维生素K及其2，3-环氧化物（维生素K环氧化物）的相互转化而发挥抗凝作用。羧基化能够促进凝血因子结合到磷脂表面，进而加速血液凝固；而华法林抑制羧基化过程。该基因的等位基因变异与维生素K依赖性凝血因子结合缺乏以及对华法林（一种维生素 K 环氧化物还原酶抑制剂）抵抗或敏感性增加有关。

华法林抵抗

华法林是一种广泛使用的抗凝剂，用于预防深静脉血栓形成、房颤或心脏机械瓣膜置换的受试者血栓栓塞性疾病。剂量要求在个体间和种族间变化很大，通常为那些有血栓风险的人而开。一些具有华法林抵抗的人对这种药物根本没有反应，而另一些人可以获得高剂量华法林治疗的好处，这种现象称为华法林抵抗。在任何一种情况下，当给予标准剂量的华法林时，受影响的人仍然会面临较高的血栓风险。华法林的新陈代谢和药物在体内的作用是由多种基因以及环境和生活方式因素（如性别、年龄、体重、饮食和其他药物）决定的复杂特征。VKORC1是华法林的靶位点。具体而言，华法林抑制VKORC1以阻止凝血因子激活所需的还原形式的维生素K的再生。研究表明VKORC1基因多态性可解释约37.8％华法林稳定剂量的个体差异。

Vkorc1基因敲除小鼠表型

在2-3号外显子上下游插入loxP位点，可通过与特异性Cre重组删除loxP间的序列，只残留loxP位点在基因座中。

图2. Vkorc1基因敲除小鼠打靶策略

当与CMV-Cre小鼠（广泛性Cre工具鼠,，介导基因全身性敲除）交配时，Vkorc1^-/-小鼠以预期的孟德尔比率出生，但腹腔内出血2-5天内死亡；出生的纯合子小鼠无法存活到2周。

Vkorc1^fl/fl小鼠与OC-Cre小鼠一起繁殖，仅在成骨细胞中失活Vkorc1基因；与Vkorc1^-/-小鼠不同，Vkorc1^fl/fl；OC-Cre小鼠是有活力的，没有出现任何明显的止血缺陷。血清中不同形式的骨钙素（OCN）的测定显示，在Vkorc1^fl/fl;OC-Cre小鼠中，GLA-OCN的循环水平下降了约40%，而GLU-OCN的循环水平上升了约10倍。在相同的动物中，总OCN的循环水平不受影响。又因小鼠是食粪动物，当防止食粪症时，Vkorc1^fl/fl;OC-Cre小鼠的循环GLA-OCN水平进一步降低；通过在培养基中添加大量（微摩尔）VK1可以挽救Vkorc1^-/-成骨细胞中OCN γ-羧化缺陷。

这些结果表明，虽然VKORC1是成骨细胞中OCN γ-羧化所必需的，但它的缺失可以通过外源性高浓度VK1来补偿。

图3. Vkorc1fl/fl;OC-Cre小鼠中OCN γ-羧化的有效降低

根据这一结果，注射大剂量的VK1纠正了缺乏功能性VKORC1的小鼠或人或用VKORC1抑制剂华法林治疗的大鼠的出血缺陷。

VKORC1基因突变导致普遍的维生素K依赖性凝血因子缺乏和华法林抵抗。药物遗传学研究表明，VKORC1基因中的单核苷酸多态性 （SNP） 与华法林剂量要求之间存在很强的关联。筛选影响华法林剂量的VKORC1多态性可能有助于在口服抗凝剂治疗开始时调整剂量，以降低血栓形成和出血风险。

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参考文献：

1. Garcia AA, Reitsma PH. VKORC1 and the vitamin K cycle. Vitam Horm. 2008;78:23-33. doi: 10.1016/S0083-6729（07）00002-7. PMID: 18374188.

2. Ferron M, Lacombe J, Germain A, Oury F, Karsenty G. GGCX and VKORC1 inhibit osteocalcin endocrine functions. J Cell Biol. 2015 Mar 16;208（6）:761-76. doi: 10.1083/jcb.201409111. Epub 2015 Mar 9. Erratum in: J Cell Biol. 2019 Jun 3;218（6）:2071. PMID: 25753038; PMCID: PMC4362468.

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