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基因组点突变所产生的基因组单核苷酸多态性（SNP）变异是人类疾病发生、生理生化表型差异的内在原因之一。众多研究表明，点突变能增加人类在癌症、听力疾病、精神病等多种疾病的易感性。如结直肠癌（CRC），基因组范围的关联研究（GWAS）提供了许多关于CRC遗传易感性的信息，在欧洲和亚洲人群中发现了50多个与CRC相关的SNP，并且大多数位点位于非编码区。这些SNP的生物学功能和导致CRC的发病机制尚不完全清楚，所以CRC的发病机制、诊断治疗仍然需要深入研究。下面以一篇文献来介绍这方面研究的进展。

 与CRC发病相关的风险SNP筛选

作者首先查阅了相关的报道，发现突变位点rs6687758与CRC相关。然后调取TCGA数据库中的CRC样本数据，由于rs6687758不存在于TCGA样品的SNP阵列6.0中，而另一个突变位点rs6695584与rs6687758强连锁不平衡，因此用rs6695584作为rs6687758的代替，再进行分析。发现G等位基因（GG+GA）患者3年总生存期短于AA基因型患者，提示SNP危险基因rs6695584在结直肠癌的发生发展中起重要作用（图1a）。

由于rs6695584处于基因间隔区，所以作者接下来寻找该SNP可能会影响哪些基因。通过数量性状位点（EQTL）分析发现rs6695584与lncSLCC1的相关性最强（图1b）。进一步的数据显示，rs6695584的GG或GA基因型样品的lncSLCC1表达显著高于AA基因型的（图1c）。暗示rs6695584可能通过调节lncSLCC1的表达而参与CRC的进展。

那么rs6695584是怎么影响lncSLCC1的表达水平呢？作者通过Hi-C实验分析三个常见CRC细胞系（Caco 2、DLD-1和RKO）的基因型，发现rs6695584与lncSLCC1启动子有较强的相互作用（图1d）。通过荧光素酶报告实验，发现S1的活性显著高于对照载体和其他片段（图1e、f、g）。同时查阅ENCODE数据库中rs6695584位点的组蛋白修饰情况，H3K27ac、H3K4me1和H3K4me3芯片数据也说明了rs6695584位点具有较强的转录活性（图1h）。接着作者猜测rs6695584的突变会影响转录因子在此处结合的能力，继而通过影响lncSLCC1启动子来调控lncSLCC1的表达水平。因此作者查阅了FIMO和Jaspar数据库中可能与rs 6695584结合的转录因子，发现转录因子BATF能与rs6695584结合（图1i）。

至此，作者通过挖掘数据库，发现rs6695584能通过影响转录因子BATF的招募来改变lncSLCC1的表达，导致CRC的发生。

图 1. CRC相关风险SNP rs6695584作为增强子调控lncSLCC1的表达

 lncRNA-SLCC1在CRC中的临床意义

为了继续研究lncRNA-SLCC1在CRC中的临床意义，作者发现lncSLCC1在结直肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织（图2a、b、c）。通过Kaplan-Meier分析，发现lncRNA-SLCC1的高表达与不良的预后密切相关（图2d）。同时TCGA数据库的数据也证实了lncSLCC1在结直肠癌组织中的表达明显高于相应的正常组织，并且lncSLCC1的高表达预示着预后不良（图2f、g）。此外，TCGA数据库的临床病理分析表明，lncSLCC1的表达与淋巴结浸润、转移和AJCC分期呈正相关（图2h）。

图 2. lncRNA-SLCC1在结直肠癌的临床意义上具有重要意义

 lncSLCC1通过驱动糖酵解代谢激活CRC

为了阐明lncSLCC1在CRC中的作用，作者在DLD-1细胞系的基础上敲低lncSLCC1，在HT-29细胞系中过表达lncSLCC1。然后比较了lncSLCC1基因敲低的DLD-1细胞系与对照DLD-1细胞系的RNA-seq的结果。发现与糖酵解途径和结直肠癌发生特征相关的基因组与lncSLCC1敲低的结直肠癌细胞呈负相关（图3a）。此外，通过质谱代谢组学分析。发现敲低lncSLCC1能降低葡萄糖代谢信号的关键成分水平，如乳酸。

细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）能反映结直肠癌细胞的糖酵解代谢。作者在lncSLCC1敲低的DLD-1细胞系中检测，发现乳酸生成（糖酵解的关键代谢产物）、ATP生成、ECAR和OCR水平均显著降低（图3b、c、d）。而过表达lncSLCC1能显著增加HT29细胞的乳酸生成、ATP生成、ECAR和OCR水平（图3e、f、g）。为了进一步研究lncSLCC1对糖酵解的影响，作者使用18F-FDG PET（[18F]-氟-2-脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描术），小鼠PET-CT数据显示，敲低lncSLCC1可显著降低异种移植小鼠肿瘤模型中的葡萄糖摄取（图3h）。同时敲低lncSLCC1能显著抑制DLD-1细胞的增殖和集落形成（图3i、j）。另外，敲低lncSLCC1还能显著抑制DLD-1肿瘤的生长（图3k）以及肿瘤重量（图3l）和肿瘤体积的增长（图3m）。而过表达lncSLCC1可促进细胞的增殖和菌落形成（图3n、o）。这些数据表明，lncSLCC1可能通过激活糖酵解信号而促进CRC的进展。

图 3. lncSLCC1驱动糖酵解代谢激活CRC增殖

 lncSLCC1与AHR相互作用并调节HK2的表达

作者为了筛选可能与lncSLCC1互作的因子，然后采用pull down、质谱和Western blotting等方法进行了筛选和验证。发现了转录因子AHR能与lncSLCC1互作（图4a、b、c、d）。为了探讨AHR在CRC进展中的作用，作者继续构建AHR基因敲低的细胞系。并且发现敲低AHR能降低细胞增殖，同时也下调糖酵解相关通路的基因表达（图4e）。

为了进一步研究AHR与lncSLCC1相互作用的功能，作者用rna-seq检测对照细胞和AHR基因敲低细胞，发现对照组有267个lncSLCC1上调基因显著富集（图4f）。这些数据支持了AHR和lncSLCC1通路上调下游糖酵解基因，从而促进CRC进展的假说。进一步的分析表明，参与糖酵解通路的HK2在AHR基因敲低和lncSLCC1基因敲低的细胞系中同时被下调（图4g）。并且发现在HK2的启动子序列上存在两个预测的AHR结合位点（图4h）。

然后作者在lncSLCC1表达下调的DLD-1细胞系中发现AHR与HK2启动子的结合效率显著降低（图4h）。同时通过荧光素酶实验，显示敲低lncSLCC1可降低DLD-1中HK2启动子的转录水平（图4i）。qPCR和western blot数据显示，转染lncSLCC1-smart silencer后，DLD-1细胞系中HK2的表达显著下调（图4j）。相反，当过表达lncSLCC1则可以促进了HT 29细胞HK2的转录水平，增加了HK2的表达（图4k、l）。这些数据表明，lncSLCC1可能正调控CRC细胞中HK2的转录。

图4. lncSLCC1能与AHR互作并调节HK2的表达

 HK2是lncSLCC1的功能靶基因

然后作者接下来研究HK2是否在CRC中介导了lncSLCC1的生物学功能。首先，在DLD-1细胞系中转染对照组、lncSLCC1-smart silencer或共转染lncSLCC1-smart silencer 和HK2过表达质粒。体外功能测定显示，HK2的过度表达可明显抑制由lncSLCC1下调所引起的细胞增殖速度降低（图5a）和菌落形成数量减少（图5b）。然后在小鼠皮下注射DLD-1细胞，建立结直肠癌异种移植模型。用瘤内多点注射法注射对照组、lncSLCC1 shRNA、lncSLCC1 shRNA和HK2高表达病毒。体内数据表明，HK2的上调能抑制由lncSLCC1表达下调所引起的肿瘤生长降低（图5c、d、e）和肿瘤重量（图5f）下降。为验证HK2在lncSLCC1介导的糖酵解代谢激活中的作用，在转染对照组、lncSLCC1-smart silencer或共转染lncSLCC1-smart silencer和HK2高表达质粒的DLD-1细胞系中检测乳酸水平和ATP生成。结果表明过表达HK2能抑制由lncSLCC1下调所引起乳酸生成降低（图5g）和ATP生产降低（图5h）。此外，体内实验进一步证实，过表达HK2能显着地抑制lncSLCC1的下调导致葡萄糖摄取的减少（图5i）。因此，作者的数据表明，在CRC中，lncSLCC1通过调节HK2介导糖酵解代谢和细胞增殖。

图5. HK2是lncSLCC1在结直肠癌中的功能靶基因

 lncSLCC1和HK2在CRC患者中的表达及其临床意义

作者为了探讨lncSLCC1与HK2的临床相关性，用CRC患者组织进行了免疫组织化学染色。结果表明，lncSLCC1在结直肠癌组织中的表达与HK2表达呈正相关（图6a、b）。并且评估了HK2的表达强度与CRC患者的生存率之间的关系，这一分析表明HK2在结直肠癌组织中的高表达预示着存活时间的缩短。（图6c）。这些数据表明，lncSLCC1及其靶基因HK2的高表达水平可能有助于判断预后不良的CRC患者。

图6. lncSLCC1和HK2在CRC患者中的表达与临床相关

 小结

综上所述，基于作者的数据得出了一个CRC的致病模型，即rs 6695584风险等位基因提高了lncSLCC1的丰度，进而形成AHR-lncSLCC1复合物，导致靶基因HK2的上调，最终促进CRC的进展。

作者通过对数据库的挖掘与分析，筛选出与CRC相关的风险SNP和lncSLCC1。再构建一系列基因过表达和干扰等体内体外模型，再以模型为基础，通过组学分析、基因功能分析、生理生化检测等手段，验证了风险SNP与lncSLCC1的功能，并且探索研究了以lncSLCC1为中心的CRC致病机制。

从这篇文献我们可以看出，一个具有深度的研究需要基于数据的挖掘与分析、体内体外模型的构建、巧妙的实验设计、高效精准的检测手段和实验数据分析能力。赛业生物长期致力于基因编辑细胞和动物模型的建立，拥有经验丰富的专家团队和成熟稳定的技术平台，客户遍布全球几十个国家和地区。我们可为客户提供目的基因的表达调控的细胞模型和动物模型，以及相关的表型检测、功能验证、病理分析等一系列的服务，为广大科研工作者提供便捷的服务。如有需要，欢迎联系我们~

原文检索：

Yan, Tingting, et al. “Risk SNP-Induced LncRNA-SLCC1 Drives Colorectal Cancer through Activating Glycolysis Signaling.” Signal Transduction and Targeted Therapy, vol. 6, no. 1, 2021, pp. 70–70.