CB2通过与β-catenin通路相互作用促进肾脏纤维化的发生发展

2021年2月，南方医科大学南方医院肾内科周丽丽教授团队与广西右江民族医学院附属医院肾内科团队联合在肾病领域排名第一的杂志Kidney International发表了题为“Cannabinoid receptor type 2 promotes kidney fibrosis through orchestrating β-catenin signaling”的文章。该研究证实了肾小管上皮细胞损伤后可以引起大麻素受体2（CB2）活化表达上调，继而诱导β-arrestin1/Src形成三聚复合体促进β-catenin活化发生酪氨酸磷酸化进一步转位入核从而引起下游的级联反应。此外β-catenin可以继续调控CB2的基因转录水平，推测CB2与β-catenin通路存在交互作用，形成一个正反馈调节环从而促进肾脏纤维化的发生发展。

慢性肾脏病（CKD）是一组以进行性发展为特点的难治性疾病，其发病率、死亡率高，早已引起医学界的广泛关注和重视。研究表明全球共有6.975亿慢性肾脏病（CKD）患者，患病率为13.4%，其中我国的CKD患病人数高达1.32亿。终末期肾衰竭（ESRD）是不同CKD进展的终末阶段，除了透析替代治疗以及肾移植，尚无有效治疗方法。前期研究中发现内源性大麻素系统（ECS）可参与肾脏纤维化的疾病进展，ECS的重要组分大麻素受体2（CB2）可以促进肾脏纤维化的发生发展，但是其具体机制尚不清楚。

研究材料

该研究中体内实验采用了雄性C57BL/6小鼠，Cnr2（CB2）基因敲除小鼠（赛业生物提供）。体外实验应用了人肾小管上皮细胞系HKC-8。

技术方法

该研究中应用了蛋白质印迹法、QPCR、免疫组织化学染色、免疫荧光染色、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀等关键技术方法。

技术路线

研究结果

1.CB2在肾脏损伤中呈时间依赖性表达上调且与纤维化程度成正相关。

研究发现，CB2在损伤肾脏中表达上调，主要表达于肾小管上皮细胞中，主要分布在近端和远端肾小管上，并且呈现时间依赖性增加。同时对CB2和肾脏纤维化程度以及肾脏损伤程度进行相关性分析，发现存在显著相关性。

图1 CB2在损伤肾脏中是时间依赖性诱导增加的，并与纤维化水平呈显著正相关

(a)缺血再灌注损伤(IRI)后肾脏中CB2表达和胶原沉积染色的代表图片。(b,c)相关性分析显示CB2与IRI小鼠模型中纤维化程度或肾脏损伤指标(NGAL)表达呈正相关。(d)Western blot检测纤维化分子Fibronectin、α-SMA以及损伤分子Kim1的表达水平。(e-g)Western blot的统计结果。(h)CB2和肾小管各种节段特异性标志物在IRI小鼠肾脏中的共定位染色。应用FISH染色CB2(红色)以及节段特异性小管标记（绿色）:近端小管(LTL);远端小管(PNA);集合管(DBA)。箭头指示阳性小管与CB2和特异性小管标志物共定位。(i,j)相关性分析显示单侧输尿管梗阻(UUO)肾脏中CB2 mRNA水平与纤维化程度以及NGAL mRNA水平呈正相关。(k) UUO肾脏中CB2和Fibronectin染色的代表图片。

2.CB2激活β-catenin促进肾脏纤维化

在体外对CB2促纤维化机制进行探究。应用CB2激动剂AM1241，可以明显诱导β-catenin活化，促进β-catenin转位入核。在体外HKC8细胞中，过表达CB2可以诱导β-catenin通路活化，并引发下游级联反应。而应用β-catenin抑制剂ICG-001则可以显著缓解小管上皮细胞的损伤和纤维化。

图2 CB2通过激活β-catenin促进肾脏纤维化

(a)免疫荧光结果显示AM1241促进HKC-8细胞β-catenin转位入核。

(b)Western blot检测Wnt1和AM1241刺激HKC8细胞Fibronectin、MMP7以及Kim1的蛋白水平。

(c)Western blot的统计学结果。

(d-h)Western blot检测HKC8细胞转染CB2过表达质粒后纤维化指标以及β-catenin通路指标的蛋白水平以及统计学结果。

(i)免疫荧光结果显示Fibronectin的表达水平。(j-n)Western blot检测AM1241刺激HKC8细胞后纤维化指标以及β-catenin通路指标的蛋白水平以及统计学结果。

3.CB2与Wnt1协同诱导单侧缺血再灌注损伤(UIRI)小鼠肾纤维化

在小鼠体内对CB2促纤维化的作用进行充分验证，结果证实，单纯Wnt1过表达质粒可以上调UIRI小鼠的肾脏纤维化水平，而外源性导入CB2过表达质粒以后，可以协同加重小鼠肾脏损伤以及肾脏纤维化程度。

图3 CB2与Wnt1协同诱导单侧缺血再灌注损伤(UIRI)小鼠肾纤维化

(a)实验设计图。

(b)QPCR检测小鼠肾脏CB2的mRNA水平。

(c)不同组CB2和Masson三色染色的染色结果。

(d)纤维化面积统计结果。

(e)血清肌酐统计结果。

(f-h)Western blot检测纤维化指标的蛋白水平以及统计学结果。

(i)免疫染色结果显示Fibronectin和CollagenI的表达水平。

4.进一步证实CB2是β-catenin的下游靶点

β-catenin对CB2的作用究竟是如何呢，研究人员通过免疫共沉淀以及染色质免疫共沉淀的方法来进行验证，发现β-catenin可以介导CB2的转录调控，从而构成一个正反馈调节环。

图4 CB2是β-catenin的下游靶点

(a)生物信息学分析显示，在人类和小鼠CB2基因的启动子区域存在假定的TCF结合位点。

(b)染色质免疫沉淀(ChIP)检测结果显示TCF或LEF-1与CB2基因启动子区结合。

(c)转染β-catenin后检测CB2 mRNA的水平。

(d,e)Western blot检测CB2上调水平与统计结果。

(f)免疫共沉淀结果显示β-catenin诱导CB2/β-arrestin 1/Src复合物的形成。

(g-i)Western blot检测CB2、β-arrestin 1以及Src的表达水平以及统计学结果。

(j)研究机制示意图。

5.通过CB2-KO小鼠验证CB2抗体的特异性和Cnr2 FISH探针的特异性

采用CB2敲除小鼠（赛业生物提供），通过PCR、Western blot、免疫组化以及原位杂交等方法对本研究中所使用的特异性抗体以及特异性FISH探针的特异性进行验证。

图5 在CB2-KO小鼠肾脏中验证CB2染色的特异性

(a)免疫组化显示CB2在肾脏UUO和IRI模型中的表达水平。

(b)IRI7天小鼠肾脏中对CB2和MR进行共定位染色。

(c)在CB2基因敲除小鼠肾脏应用PCR进行基因型鉴定。

(d)免疫组织化学染色在WT和CB2-KO小鼠UUO术后对CB2表达水平进行检测。

(e)Western blot检测WT和CB2-KO小鼠中CB2的表达水平。

(f)原位杂交(FISH)检测CB2在WT和CB2-KO小鼠肾脏中的基因水平。

(g)原位杂交检测WT和CB2-KO小鼠UUO术后肾脏CB2的基因水平。

总结

综上所述，目前关于CB2在肾脏中的研究主要集中于AKI和糖尿病肾病中，普遍认为CB2在肾脏中具有保护作用，但是CB2在CKD以及肾脏纤维化中的系统研究较少且颇具争议。研究人员前期的研究发现CB2是CKD治疗中的一个新靶点，但是其具体机制还尚不清楚。因此，研究人员将重点围绕CB2在肾脏纤维化中所介导的作用进行了探讨，并对其具体的分子机制进行深入研究。本次研究阐明了肾小管上皮细胞损伤引起CB2表达上调，继而诱导β-arrestin 1和Src形成复合体促进β-catenin活化发生酪氨酸磷酸化进一步转位入核继而引起下游的级联反应。此外β-catenin可以继续调控CB2的基因转录水平，CB2与β-catenin通路存在交互作用，形成一个正反馈调节环从而促进肾脏纤维化的发生发展。

补充说明

南方医科大学南方医院肾内科周丽丽教授为通讯作者。南方医科大学南方医院肾内科博士后周姗、博士研究生武秦羽和右江民族医学院肾内科林栩教授为共同第一作者。南方医院肾内科实验室为该研究提供了技术和平台支持。

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参考文献：

Zhou S, Wu Q, Lin X, Ling X, Miao J, Liu X, Hu C, Zhang Y, Jia N, Hou FF, Liu Y, Zhou L. Cannabinoid receptor type 2 promotes kidney fibrosis through orchestrating β-catenin signaling. Kidney Int. 2021 Feb;99(2):364-381.