囊性纤维化的机理研究【罕见病并不罕见】

致病基因

囊性纤维化（pulmonary cystic fibrosis，CF）是常见的常染色体隐性遗传病，属于单基因病，是CFTR基因突变引起的。主要影响上皮组织的正常功能，如气道上皮细胞、小肠、胰腺、肝脏、唾液腺、生殖道等。

CFTR基因位于7号染色体长臂（7q31.2），全长250kb，共1480个氨基酸，有27个外显子和26个内含子。该基因正常编码产生一种称为CF跨膜调节器（CFTR）的蛋白，具有12个跨膜结构域和2个核苷酸结合域（NBD1/2），还含有一个调节区R。该调节区含有蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)共有的磷酸化位点，被蛋白激酶磷酸化时，可以激活CFTR氯离子通道。

该蛋白还是ABC transporters家族的成员，该家族具有吸收营养物质，排出毒素，介导真核生物和细菌的细胞间通讯等功能。该蛋白表达在粘液腺体中，驱动液体和电解物的分泌，将粘液素、糖复合物、抗菌剂等从粘液腺体分泌，流入呼吸道中，促进粘液纤毛清除和自我防御。

当CFTR发生突变时，氯离子通道激活异常，影响细胞对整体盐的调控和水分的摄取，使通道中的粘液粘稠，在一些器官（如胰腺、呼吸道等）形成栓塞；在皮肤的汗管，氯化钠不能被重吸收，导致产生非常咸的汗液。

CFTR在调控离子通路的过程中发挥重要的作用，CFTR主要介导细胞内氯离子跨膜向细胞外运动，同时伴随水分子的转运。CFTR控制氯离子通道打开的过程是：cAMP的水平提高后促使磷酸激酶磷酸化R结构域中的丝氨酸；磷酸化后，促使ATP结合NBD结构域；当NBD1末端的磷酸基被剪切，CFTR的立体构象也发生改变，离子通道打开，氯离子流出；之后，当NDB2的ATP被水解时，CFTR的立体构象再次发生改变，通道被关闭。

CFTR除了本身能介导氯离子的外流之外，还能通过ROMK2与细胞内的NBD1和调控R结构域相互作用，介导钾离子向细胞外运输；还能结合ATP到PY2R蛋白上调控ORCC介导的氯离子外流通道，并且能抑制ENaC蛋白活性进而调控钠离子的内流。

目前在CFTR上发现的突变有1800多种，研究人员将CFTR基因的突变分为了六大类。在正常的细胞内，功能正常的CFTR蛋白将会被转运到细胞膜上。

小鼠模型

人与小鼠在氨基酸序列的同源性是78%，通过在该基因10号外显子中插入终止密码子（S489X）构建了第一种CFTR敲除小鼠CFTR^tm1UNC，该小鼠模型具有比较严重的肠道并发症。

通过其他方法得到的CFTR全基因敲除小鼠模型有CFTR^tm1CAM、CFTR^tm1HSC、CFTR^tm1BAY和CFTR^tm3BAY。这些小鼠品系都检测不到野生型CFTR的mRNA，其中CFTR^tm1CAM具有胰管严重阻塞的肠道表型，CFTR^tm1HSC、CFTR^tm1BAY和CFTR^tm3BAY都具有严重的肠道并发症。

除了敲除模型，还有KI突变点的模型，如产生Class II突变的△F508小鼠模型CFTR^tm1EUR、CFTR^tm1KTH、CFTR^tm2CAM；G480C突变的小鼠模型CFTR^tm2HGU；Class III突变的G551D小鼠模型CFTR^tm1G551D。其中CFTR^tm1EUR突变小鼠会导致不致命的肠道异常表型，但在胰腺和肝脏没有异常；CFTR^tm1KTH突变小鼠的精子具有异常表型，但胆囊和胰腺没有异常，生存周期比敲除小鼠长。

使用敲除小鼠和KI小鼠模型研究囊性纤维化，具有较容易构建、繁育周期短以及饲养成本低的优点，但由于不同物种模型之间的疾病严重程度不一致，因此有一定的限制。

比如，这些小鼠模型能显示出与患者相似的严重肠梗阻、生长抑制和鼻电生理学改变，但无法在未攻毒的情况下产生自发性肺部感染。并且大部分实验结果显示，在小鼠的胰腺、肝脏和输精管只有轻微并发症，这与患者的症状具有很大差异。造成这种结果的原因可能是，小鼠中低表达量的CFTR可产生足够的离子转运能力，从而使其严重程度较轻，此外小鼠中存在另外的上皮表达的氯离子通道可以代偿CFTR的离子通道功能。

于是，为突破该限制，有研究人员通过将包含了人源CFTR基因的细菌人工染色体（BAC）转入敲除了CFTR的小鼠中。实验结果显示，表达人源CFTR小鼠的相关肠道、呼吸道异常的表型与患者接近。该实验也证明了，CFTR基因在小鼠和人之间具有一定的保守性。

非编码区研究

研究人员在CFTR的5’UTR中选择绿框的部分，将突变体作为荧光素酶的5’ UTR，并通过荧光素酶的荧光判断序列的功能。结果显示，当uAUG突变为uUUG，并突变lower stem的序列时，相较于野生型的CFTR的5’UTR序列，突变体序列荧光素酶的表达效率显著得到提高。此外，还发现突变top stem的序列时也出现了类似的结果。该研究成果提示了CFTR的5’ UTR所具有的潜在治疗价值。

RDDC助力CF等罕见病研究