【创新】CRISPR+光遗传学:用光控制基因组编辑

日期: 2017年09月15日


    

导读:近年来,科学家结合CRISPR和光遗传学技术,开发出各种光激活的CRISPR工具。这些工具让研究人员能够利用光从外部控制基因组编辑过程的地点、时机和可逆性。今天,赛业小编为您推荐“【创新】CRISPR+光遗传学:用光控制基因组编辑”,详情如下:


作为经常上头条的明星,CRISPR和光遗传学(optogenetics)这两个技术的碰撞会产生什么样的火花?2015年,科学家结合CRISPR和光遗传学技术,开发出各种光激活的CRISPR工具。这些工具让研究人员能够利用光从外部控制基因组编辑过程的地点、时机和可逆性。


从时空上控制转录


最初的光激活CRISPR系统于2015年年初发表,侧重于利用光来控制转录。两个独立的实验室,东京大学的Moritoshi Sato实验室和杜克大学的Charles Gersbach实验室,基于光诱导的异源二聚体隐花色素2(CRY2)和整合素结合蛋白1(CIB1),开发出相似的系统。他们的目标是利用光来开启和关闭基因的表达,同时赋予时空控制和可逆性。


Nihongaki等人开发出的系统是由两个融合蛋白组成的:1) 基因组锚定物 – 失活的Cas9蛋白(dCas9)与CIB1融合;2) 激活物 – CRY2光裂合酶同源区域(CRY2PHR)与转录激活域(VP64或p65)融合。一旦在细胞中表达,在gRNA指引下,dCas9-CIB1与目标DNA序列结合,而CRY2PHR-激活物自由漂浮。在蓝光的照射下,CRY2和CIB1二聚化,带来激活物,激活基因转录。


研究人员测试了多种组合来优化融合蛋白。他们发现,表现最好的组合是NLS-dCas9-trCIB1和NLSx3-CRYPHR-p65。在蓝光(470nm)的照射下采用狭缝模式,研究人员发现,人ASC1基因的表达可被空间控制。他们还不断开启和关闭蓝光,发现ASC1的表达也跟着做,说明控制的确是可逆且可重复的。


Polstein等人开发的光激活CRISPR/Cas9效应物(LACE)系统也采用了相似的策略,不过采用了不同的融合蛋白组合。经过优化的LACE系统包括:1) CIBN-dCas9-CIBN,其中CIBN是CIB1的N端片段,与dCas9的N端和C端融合;2) CRY2FL-VP64,全长的CRY2与转录激活域VP64融合。在HEK293T细胞中利用此系统来诱导人IL1RN的表达,研究人员发现2小时后mRNA水平提高11倍,30小时后提高400倍。此系统也被证明是可逆的和可重复的。


光活化的基因组修饰


之后,Sato实验室又推出了光活化系统来切割目标DNA序列,它产生的双链断裂(DSB)可通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)来修复。这个系统的独特之处在于它利用了一种“分裂的”核酸酶。作者将Cas9分成N端(2-713个残基,N713)和C端(714-1368个残基,C714)。作者将每个Cas9片段与一个二聚化的结构域相融合,创建了光活化的Cas9工具。


尽管作者尝试了几种不同的光活化设计,但他们最成功的设计是利用了磁性光控蛋白,来源于真菌感光体Vivid。这个新系统的昵称为paCas9-1,包含融合蛋白N713-pMag和nMagHigh1-C714,显示出低背景和高的诱导活性。与全长的Cas9相比,paCas9-1识别相同的PAM,并有着相似的定位特异性。在蓝光的激发下,paCas9-1能通过NHEJ诱导插入缺失(频率为20.5%),并通过HDR诱导修饰(频率为7.2%)。


作者还表明,他们能够通过修改paCas9-1来降低系统的背景活性。他们用nMagC714来取代nMagHigh1-C714,生成了paCas9-2。这种改变并未明显改变系统生成突变的效率,但降低了背景DSB。与他们之前的工作一样,Sato实验室还表明paCas9-2可以在空间上控制,并通过蓝光开关来可逆激活。


正如人们所期望的,Nihongaki等人证明,替换融合物中的Cas9结构域,也可以生成光活化的切口酶和抑制物(dCas9)。所有变异体的活性都是可逆且可重复的。


罩住CRISPR


此外,Alexander Deiters的实验室则采用了一种不同的方法来调控CRISPR。他们利用遗传编码的光罩(photocaging)技术,在Cas9蛋白上插入了一个可光去除的保护基团,也就是硝基苯罩住的赖氨酸(PCK)。为了在Cas9的特定位点插入PCK,研究小组使用了吡咯赖氨酰tRNA合成酶,在到达琥珀终止密码子时加入PCK。


研究人员首先检验了罩住Cas9的哪个赖氨酸能够让蛋白的切割能力更好地失活,发现是K866赖氨酸。然后,他们利用双报告基因荧光检测,证明Cas9 K866PCK突变体的确失活,而用紫外光(365nm)照射后,它显示出与野生型Cas9同样的切割活性。最后,研究人员证明,这种光罩Cas9系统能够让内源的基因表达沉默。


如今,无论你想激活、抑制或修改基因,你身边都有工具,通过光来控制基因组编辑。随着CRISPR和光遗传学的发展,我们期待未来看到更多更酷的应用。


来源:生物通——由赛业生物科技有限公司转载发布

  

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