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哈尔滨医科大学进一步解析lncRNA在心肌梗死中的作用


    

心肌梗死(MI)是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死,常危及生命。据统计,我国每年发生急性心肌梗死的患者大约为100万人,而且25岁以上人群发病率逐步上升,特别是35-44岁人群的发病率上升幅度最大。因此,寻找心肌梗死的新治疗靶点具有重要意义。

 

近日,哈尔滨医科大学的研究人员进一步阐明了长链非编码RNA— ZFAS1在心肌梗死发病中的作用。这项研究成果有望帮助人们开发出心肌梗死的新型治疗策略,保护心肌细胞免受线粒体介导的凋亡。这篇题为“lncRNA-ZFAS1 induces mitochondria-mediated apoptosis by causing cytosolic Ca2+overload in myocardial infarction mice model”的文章于2019年12月发表在《Cell Death & Disease》杂志上。哈尔滨医科大学的张莹和张勇为共同通讯作者。

 

 

心肌梗死的发病机制涉及到多种状况,而心肌细胞凋亡是最关键的部分。线粒体介导的凋亡通路(也就是内在通路)在心肌细胞的凋亡中起重要作用。近期的研究证实,细胞内钙超载可诱导线粒体介导的凋亡。不过,在心肌梗死期间,钙超载如何诱导心肌细胞凋亡还不清楚。

 

长链非编码RNA(lncRNA)广泛参与了细胞代谢、信号传导、增殖、分化、凋亡和死亡等重要过程,对心血管疾病的发生发展具有重要意义。哈尔滨医科大学的研究团队之前发现,lncRNA—ZFAS1可作为急性心肌梗死的生物标志物。此外,他们还发现ZFAS1能够抑制SERCA2a蛋白的活性,并减弱心肌的收缩功能。那么,ZFAS1是否通过钙超载来参与线粒体介导的心肌细胞凋亡呢?这个问题仍有待回答。

 

在这项最新的研究中,研究人员利用心肌梗死小鼠模型,通过功能缺失和功能获得的方法来进一步阐述ZFAS1在线粒体介导的心肌细胞凋亡中的作用。

 

ZFAS1的敲低抑制心肌细胞凋亡

 

研究人员通过手术造模建立了心肌梗死小鼠模型,并确认MI小鼠的心脏功能明显下降。他们接着采用功能缺失(loss-of-function)策略,利用病毒介导的ZFAS1-shRNA(shZFAS1-V)对ZFAS1进行敲低,发现这几乎消除了心肌梗死引起的线粒体肿胀和肌原纤维断裂。同样地,他们还利用siZFAS1在新生小鼠心肌细胞(NMCM)中开展实验,发现ZFAS1敲低可恢复经过低氧处理的心肌细胞的活力。

 

为了进一步评估ZFAS1对线粒体的影响,他们开展JC-1分析以评估细胞凋亡过程中线粒体膜电位的损失。结果表明,转染siZFAS1的细胞表现出绿色荧光的减少,表明这些细胞可能对低氧诱导的心肌细胞凋亡具有抗性。之后的TUNEL检测和Annexin V/PI双重染色结果也表明,用siZFAS1转染后,凋亡细胞的数量显著下降。这些结果表明,ZFAS1的敲低可保护心肌细胞免受凋亡(图1)。在分子水平上,心肌梗死小鼠心脏中促凋亡蛋白caspase-3、caspase-9和Bax蛋白的表达显著增加,而抑凋亡蛋白Bcl2的表达则降低。不过,shZFAS1-V逆转了这些蛋白的异常表达。

 

ZFAS1的敲低抑制了由心肌梗死引起的心肌细胞凋亡

图1. ZFAS1的敲低抑制了由心肌梗死引起的心肌细胞凋亡

 

ZFAS1的过表达诱导心肌细胞凋亡

 

既然ZFAS1敲低可保护心肌细胞免受凋亡,那么ZFAS1在正常小鼠和NMCM中的过表达应该能够重复心肌梗死的表型和低氧诱导的细胞凋亡。为了验证这一假设,研究人员在后续实验中采用了功能获得(gain-of-function)方法。他们构建了携带ZFAS1基因的AAV载体(ZFAS1-V)用于体内条件下的过表达,并将pCDNA-ZFAS1载体(ZFAS1-P)转染到NMCM内,用于体外条件下的过表达。

 

与ZFAS1沉默形成鲜明对比的是,通过尾静脉注射ZFAS1-V会引起线粒体肿胀,在蛋白质水平上会导致caspase-3、caspase-9和Bax的表达升高以及Bcl2的表达下降。在细胞水平上,ZFAS1-P转染的NMCM表现出细胞活力受损,TUNEL分析表明ZFAS1过表达引起心肌细胞凋亡。在亚细胞水平上,转染后的NMCM表现出Bcl2蛋白的下调和Bax蛋白的上调(图2)。

 

ZFAS1在健康小鼠中的过表达诱导凋亡

图2. ZFAS1在健康小鼠中的过表达诱导凋亡

 

ZFAS1通过抑制SERCA2a和引起钙超载而诱导心肌细胞凋亡

 

为了进一步研究ZFAS1在心肌梗死中的作用,研究人员委托赛业生物构建了心脏特异性的ZFAS1敲入(TG)小鼠,构建过程如图3。这些小鼠表现出心脏功能受损和钙稳态失衡,且SERCA2a的表达和活性受到抑制。与对照组相比,ZFAS1敲入小鼠的心脏组织中的凋亡相关蛋白caspase-9和 caspase-3显著增加,而Bcl2降低。总的来说,SERCA2a的下调和功能失调诱导了ZFAS1-TG中的心肌细胞凋亡。

 

BAPTA是一种钙螯合剂,可以降低细胞内游离钙浓度,减轻或消除钙超载的作用。研究人员发现,BAPTA预处理能够有效地逆转ZFAS1诱导的细胞损伤。在分子水平上,BAPTA能够抑制ZFAS1过表达介导的Bax、caspase-3和capase-9的上调。值得注意的是,ZFAS1的功能域ZFAS1-FD也模拟了全长ZFAS1在调节心肌细胞凋亡中的作用。

 

ZFAS1的敲低抑制了由心肌梗死引起的心肌细胞凋亡

图3. ZFAS1敲入小鼠的心脏功能受损且凋亡增加

 

小结

 

作者认为,这些结果及以往的其他研究结果表明,lncRNA-ZFAS1在心肌梗死的发生中起着重要作用。通过抑制SERCA2a,ZFAS1不仅导致心脏损伤,还会导致心肌细胞凋亡。同时,ZFAS1的敲低显示出对缺血性心肌和低氧心肌细胞的保护作用。这项研究进一步证实了ZFAS1有望作为治疗心肌梗死的潜在靶点。

 

原文检索:

Jiao, L., Li, M., Shao, Y. et al. lncRNA-ZFAS1 induces mitochondria-mediated apoptosis by causing cytosolic Ca2+overload in myocardial infarction mice model. Cell Death Dis 10, 942 (2019).

https://doi.org/10.1038/s41419-019-2136-6

 

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