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针不戳!基因表达调控看完这篇就懂了

基因表达调控

 

刚进实验室的小萌新,总有一种天下风云出我辈的风范,两耳不闻窗外事,一心只想发CNS

 

想要实验快速上手,首先要掌握的就是研究策略。

 

在基因功能研究中常用两种基础策略,功能减弱或缺失,功能增强或获得

 

实现基因功能减弱,可以采用RNA干扰(RNAi)技术下调目的基因表达。在RNAi使用中,siRNA或shRNA的设计是关键。长度约为21bp的siRNA与蛋白形成RISC复合物,结合目的基因的mRNA,从而使其降解,达到降低基因表达水平的目的(注意RNAi是作用于mRNA水平)。但需要引起注意的是,如果目的基因在细胞中本体表达就较低的情况下(一般ΔCT>16),就不适合用RNAi了。

 

随着CRISPR/Cas9技术的成熟,越来越多的科研人员采用基因敲除的方式实现基因彻底缺失的目的。与RNAi不同的是,基因敲除理论上可作用于基因组上所有的基因片段,并使目的基因的蛋白完全不表达,从而更有利于观察细胞表型的变化,简单来说,就是更容易做出实验结果。

 

CRISPR/Cas9基因敲除和RNAi干扰表达,哪种调控方式更好?

 

没有更好,只有最适合!

1. 两种方法没有绝对的好坏,通常RNAi技术由于操作简便,使用广泛,但CRISPR/Cas9可使基因功能丧失更彻底,因此近些年受到广泛追捧

 

2. 某些情况下不适合用RNAi,例如需要改变无法转录的DNA区域,只能用基因敲除。

 

3. 某些特殊情况,敲除该基因会导致细胞生长缓慢,停滞甚至死亡,这样获得基因敲除细胞株比较困难,因此就需要选择通过RNA干扰的手段实现功能减弱。

 

对于基因功能增强或获得来说,常用的就是过表达和基因敲入了。

 

过表达和基因敲入,如何选择?

上调表达使得功能增强通常采用的方法是将目的基因的编码区(CDS)构建到载体中,导入细胞内使目的基因的表达量显著增加。但基因在细胞内本体表达已经很高时,此时再进行过表达的调控,细胞的表型很可能不会发生变化,此外,外源高表达对细胞也是个刺激压力,会产生假阳性和假阴性的结果。

 

而对于功能获得,则常采用基因敲入的方法,例如引入标记基因序列,便于目的基因的示踪和定位,或引入调控表达元件如增强子,调控目的基因的表达;但由于受到同源重组效率和插入基因片段大小的影响,目前细胞基因敲入存在较高的技术难度,普通实验室难以开展。

 

掌握了研究策略要进行细胞水平功能性验证,貌似很简单。但开展实验后发现好像并不是那么回事。即便按照流程仔细做,实验数据也跟闹着玩似的,一次一个样,数据五花八门,说起来都是泪。

 

实验虐我千百遍,问题太多该找谁?

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