FAQ | 关于基因敲除细胞，你可能关心的问题

在我们研究基因功能的时候，基因敲除（Knock out，KO）是实现基因loss of function的重要调控方式。相比于传统的基因干扰（RNAi）技术，基因敲除可完全消除目的基因的表达，最终使其蛋白完全不表达或功能彻底丧失，也让我们可以更好地观察细胞表型的变化。

但对于基因敲除细胞模型你可能存在许多疑惑，赛业生物细胞生物学产品经理整理了部分关于基因敲除细胞模型大家常问的问题并做出了解答。看看你的问题是否已在下面得到解答。如果你还有其他问题需要解答，欢迎联系我们。

Q1  实现基因loss of function，我是要做敲低（RNAi）还是敲除？

A:

1）当敲除可能会导致细胞增殖非常缓慢或停止生长，或在细胞转染后的cell pool阶段检测效率呈显著下降趋势，即可判定可能出现敲除致死的情况，建议用RNAi；

2）由于存在部分强功能蛋白，即使表达下调了，仍然有较强的功能，如果RNAi始终做不出表型，但从有关信息推测这个基因很大可能性会出表型，建议做KO；另外，研究目的基因处于非转录区域，或者目的基因有很强的转录效率，也是无法用RNAi进行有效干扰的，则只能做KO，且KO细胞更适合进行回补实验；

3）最后，敲低跟敲除不是二选一的关系。当我们用RNAi做了基因敲低，观察到细胞表型的变化后，仍然可以进一步做敲除，让实验结论更加有说服性。

Q2  KO单克隆与KO cell pool的区别？

A:

KO单克隆是指所有细胞均由一个测序验证的纯合子细胞增殖而来的，所有细胞的基因型都是一样的。KO cell pool是指没经过单克隆化和筛选的细胞池，因此可以理解为这群细胞中包含KO纯合子，杂合子和野生型，我们在拿到KO cell pool后须根据后续的实验需求挑取单克隆。

当需要去除细胞群体干扰因素的时候，推荐使用单克隆稳定细胞株，其基因组背景相对单一，对实验结果干扰因素小。当进行系统生物学研究时，需考虑细胞群体因素，同时由于不同细胞个体差异大，而且不同整合位点的单克隆细胞株表现出来的细胞行为可能不一致，所以许多实验使用混合克隆株更能去除细胞间差异造成的干扰。因此，选择单克隆细胞株还是混合克隆细胞株，需要根据实验目的而定。

Q3  移码突变和片段敲除哪个能更好的破坏目的蛋白的功能结构域？

A:

虽然主观上我们很容易认为片段敲除对于蛋白功能域的影响更大，但其实移码跟片段敲除很多时候均可以达到理想的敲除效果。

无论是片段敲除还是移码突变均要考虑敲除片段是否为非3的倍数。即片段敲除除了要考虑敲除的片段区域之外，也要考虑敲除的区域能否引起移码突变。如果敲除的片段不能引起移码突变，蛋白仅仅是缺失了敲除区域对应的氨基酸序列，但蛋白的其他区域并不受影响。

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Q4  是否可以一定确保蛋白不表达？

A:

首先保证蛋白不表达从科学的角度上来讲，无论是采用移码突变还是片段敲除都不可能什么细胞或基因都保证蛋白不表达。例如移码突变的mRNA可能发生可变剪切，直接跳过移码部位进行翻译，导致蛋白有表达；或者蛋白表达功能域的位点刚好处于切割位点更靠前的区域等。

因此我们不会草率地说我们保证蛋白不表达，这是有悖于科学原理的，但我们可通过最优的gRNA设计，从根源上避免蛋白残留问题，再结合抗体分析，及实验过程中阶段性WB测试，为您提供科学的解决方案，让您不再为KO细胞蛋白残留问题而发愁。

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Q5  如果要做KO的回复实验，该怎么设计方案？

A:

首先，需要做回复实验的KO细胞，其建立不建议稳转gRNA+移码的策略，这是由于Cas持续表达，gRNA又是作用于外显子上的体系，回复的时候移码突变必须要做cDNA的突变，也就是同义突变，将CRISPR识别的PAM序列去掉，否则cDNA也会被切割掉。另外，片段敲除则是2条gRNA在内含子上切割，在cDNA上没有识别切割位点，所以再进行过表达的回复实验就相对比较顺利。

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