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没想到吧,腺相关病毒常见问题解答出下篇啦

腺相关病毒常见问题解答下篇 | 赛业生物

 

病毒载体包装过程是复杂的,在做病毒包装实验中,科研工作者常遇到一些问题。为了让大家在病毒包装这块少走弯路,《细胞基因编辑小课堂栏目》特邀赛业生物细胞生物学产品经理针对病毒包装常见的问题为大家进行经验总结与心得分享。继慢病毒包装之后,我们的腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)包装常见问题解答也推出了上下两篇,上篇回顾请戳这里今天我们接着进行AAV包装常见的问题解答:

 

Q1:AAV的注射方式,有尾静脉注射也有局部原位注射,该怎么选?

AAV的体内注射(给药)方式分为系统性给药和局部给药,系统性给药主要有尾静脉、颈静脉、眼眶静脉和腹腔静脉给药;

 

局部给药方式常见的包括脑立体定位、肌肉定点注射、心肌原位注射、玻璃体腔内注射、关节腔注射等;

 

系统性给药是特点是病毒注射的体积较大,一般需要100~1000μl不等,病毒在体内扩散的范围广,一般系统性给药的方式操作较为简单,给药比较方便;

 

局部给药则病毒注射量要求较少,一般100μl以内,但对滴度要求较高;由于是直接将AAV递送到目标组织,局部给药会有更好的靶向性,如果是临床基因治疗,局部给药注射的病毒量少,因此病理毒性会更小。

 

Q2:AAV注射小鼠,多少病毒量才够呢?

影响AAV注射总量的因素很多,比较重要的有血清型、目标组织类型、注射方式(局部or全身)、动物模型(如大鼠or小鼠)等,对于有文献报道的,可参考文献的注射方法,最好设置几个不同的梯度。例如AAV9感染小鼠心脏组织(心肌细胞),可采用尾静脉注射也可采用心肌多点注射的方式,尾静脉注射推荐1011 vg/mL,100μL;原点注射则推荐1010 vg/mL,20 μL/点。

 

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Q3:AAV注射后多久起效?有办法缩短其表达时间吗?

在我们的上期有提到,AAV进入细胞后需经历一个从单链DNA变成双链DNA的过程,因此,目的基因开始表达所需的时间较长,一般在1周左右或以上可以检测到,这个也跟目的基因相关,不同基因的表达高峰时间是不同的。

 

另外,可采用自互补AAV(Self-complementary Recombinant Adeno-Associated Virus ,scAAV)加快表达速度,scAAV是通过改造其中的一个ITR使得AAV可形成二聚体,其进入细胞可直接进行表达,在多种组织中表达更迅速且表达水平更高。但缺点是,scAAV的包装容量进一步缩小,约为AAV的一半,因此只能用于基因片段较小的研究。

 

Q4:AAV体内注射纯化的目的是什么?

如果是用于体外感染细胞的病毒,一般不用纯化,但对于用于注射至体内的病毒,无论是慢病毒还是AAV,均有必要进行纯化。这是由于病毒在包装生产过程中,未经纯化的病毒液含有大量的病毒外壳、细胞(293T)内毒素、破损颗粒、及细胞碎片等,这些物质如果随病毒一起注射到动物体内,可能会引发强烈的免疫反应,从而影响动物的生存状态。另外病毒纯化也是一个浓缩的过程,有利于后续的稀释使用。

 

Q5:为什么AAV是目前基因治疗领域最热门的载体?

这是因为AAV具备以下优势:

1、宿主范围广:分裂和非分裂细胞;

2、安全性高:未发现致病AAV;ITR和rep/cap独立质粒表达;

3、免疫原性低:对动物或人体造成的免疫反应小,几种病毒载体中相对最小;

4、靶向性好:多种血清型,组织特异性。

 

但目前AAV并不是完美的,仍有许多需要优化和改进的地方,如特异性还有待提高,从而减少AAV的使用剂量,降低毒理风险;通过载体改造提升载体容量,解决较大片段基因治疗的问题;另外还需要开发更多具备不同功能的AAV,如跨血脑屏障、跨突触等。

 

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