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【每周一鼠】Fus敲除小鼠的技能,到底有多少?

Fus基因敲除小鼠 | 赛业生物

 

赛业生物《每周一鼠》,每周更新,为大家讲解一个小鼠模型的故事,希望对大家了解不同的小鼠模型有所帮助。今天和大家见面的是Fus基因敲除小鼠

 

Fus基因

该基因编码异质核核糖核蛋白 (hnRNP) 复合物的多功能蛋白质组分。hnRNP复合物参与pre-mRNA剪接和完全加工的mRNA向细胞质的输出。该蛋白属于FET家族的RNA结合蛋白,其与基因表达的调节、基因组完整性的维持和mRNA/microRNA加工有关。该基因缺陷会导致肌萎缩侧索硬化。

 

人FUS基因是由15个外显子编码526个氨基酸的RNA结合蛋白,包含几个不同的功能域,包括RNA识别基序和高度保守的C端核定位信号 (NLS),许多已识别的突变发生在该区域。该结构域与尤文氏肉瘤(EWS)蛋白和TATA结合蛋白相关因子15 (TAF15)共享,它们与FUS一起被称为FET蛋白家族,最初被描述为人类恶性肿瘤中融合癌基因的一部分。[1]

图1. FUS的结构和功能域 | 赛业生物

图1. FUS的结构和功能域。[1]

 

Fus基因敲除小鼠表型

1  基因组维护和染色体稳定性

Hicks等人使用基因捕获载体随机插入FUS基因第12号外显子构建Fus敲除小鼠。该等位基因产生了一个截断的转录本,western blot分析证实该等位基因表达了低水平的截断蛋白。然而,由于缺少核酸结合域,预计表达的产物不会保留活性。

 

Fus敲除的纯合子小鼠不能哺乳,并在出生16小时内死亡(表1)。新生的Fus敲除小鼠通常是同窝中最小的,但大小不超过正常变化。从胚胎期(E) 16日到出生,Fus敲除胚胎的胸腺大小也减少,但总体胸腺结构是正常的。此外,Fus敲除小鼠发育正常,系列切片的组织学检查证实所有主要器官和组织的结构和发育正常。

表1. Fus敲除小鼠生存、死亡情况 | 赛业生物

表1. Fus敲除小鼠生存、死亡情况。[2]

 

从E14.5小鼠移植的原代成纤维细胞中制备的中期染色体分析显示,超过67%的Fus-/-细胞染色体存在非整倍性。还经常观察到其他染色体畸变,包括染色体断裂、着丝粒融合和染色体外遗传成分(EEs)的存在。对原代B淋巴细胞观测也得到了类似的结果。Fus在维持基因组稳定性方面的作用表明,在人类癌症中当Fus基因易位时,可能有助于Fus的致癌潜力。

图2. Fus-/-细胞中基因组不稳定性的发生率高 | 赛业生物

图2. Fus-/-细胞中基因组不稳定性的发生率高[2]

 

2  生殖

Kuroda等人使用基因捕获载体随机插入基因第8号外显子产生Fus敲除小鼠.该等位基因不表达完整的Fus蛋白。在129svev的近交繁殖背景下,很少有纯合敲除小鼠在断奶时还存活,没有小鼠能生长到成年。但在部分远交背景下(129svev和CD1品系杂交),Fus-/-小鼠的生存几乎没有受到损害。

 

Fus-/-小鼠与野生型的交配显示雄性完全不育,雌性的生育能力降低。后者反映在产仔数方面大约是129svev;CD1背景产仔数的一半。不育雄性表现出正常的交配行为并产生交配栓。Fus-/-小鼠附属性器官的大小与小鼠的整体大小是成比例地减小的。内生殖器解剖结构正常,精囊内含有正常量的精液。这些解剖特征和Fus-/-小鼠的正常交配行为表明雄激素功能没有受到突变的影响。

图3. 9周龄的野生型和Fus-/-小鼠雄性的内生殖器显微照片 | 赛业生物

图3. 9周龄的野生型和Fus-/-小鼠雄性的内生殖器显微照片。[3]

 

Fus-/-小鼠的睾丸只有正常大小的三分之二到一半,这是由精原上皮体积的选择性减少引起的。对13只成年Fus-/-小鼠进行组织学检查:在3/13的Fus-/-小鼠中,精原细胞保存良好,是主要的细胞。其余10例中,大部分小管中存在精母细胞,但在上皮阶段III-VIII出现粗线期细胞凋亡。因此,在上皮期 IX-XI小管中,细线期/合子期精母细胞比粗线期/双线期精母细胞多得多。此外,在第XII期小管中观察到了许多减数分裂过程中精母细胞死亡的例子。这些早期缺陷是局部的,偶尔会观察到一些圆形的精子,甚至一些形状异常的凝聚形式。该结果表明Fus-/-圆形精子细胞可能是二倍体。这些结果表明Fus的缺失导致了减数分裂过程中的重大缺陷。Leydig细胞比例的明显增加可能是由于肾小管体积的减少,而不是这些细胞的数量或大小的真正增加。野生型和突变型小鼠的睾酮水平相当,证明了这些Leydig细胞的功能正常。

图4. Fus缺陷与精子发生缺陷有关 | 赛业生物

图4. Fus缺陷与精子发生缺陷有关。( A )野生型小鼠睾丸代表性切片的显微照片。4和5中的箭头指向退化的减数分裂前精母细胞,6和7中的箭头指向Fus-/-睾丸中明显较大的圆形精子。7中的星号指向变形的细长精子。[3]

 

3  行为学

Kino等人为了最大限度地提高 Fus KO小鼠的存活率,使用Hicks等人建立的小鼠模型与ICR小鼠杂交,建立远交背景下的纯合子小鼠。

 

Fus-/-小鼠即使在90周龄时,也没有表现出明显的运动缺陷。与野生型小鼠相比,Fus-/-小鼠脊髓中胆碱乙酰转移酶阳性运动神经元的数量没有减少。此外,Fus-/-小鼠的肌肉组织学没有表现出明显的萎缩表型。还测量了Fus-/-小鼠的震颤样运动。与野生型小鼠相比,没有检测到Fus-/-小鼠的振幅有任何增加。因此,Fus基因缺陷不足以在小鼠体内诱导肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)或特发性震颤(ET)样表型。Fus-/-小鼠没有表现出ALS或ET样症状。最简单的解释是Fus功能的丧失不足以导致ALS或ET。

图5. 远交Fus-/-小鼠表型 | 赛业生物

图5. 远交Fus-/-小鼠表型。[4]

 

对Fus-/-小鼠进行行为分析发现Fus缺失改变了小鼠的部分脑功能,而运动功能未明显受损。Fus-/-小鼠表现出行为异常,即多动和焦虑相关行为的减少。

图6. 远交Fus-/-小鼠的行为分析 | 赛业生物

图6. 远交Fus-/-小鼠的行为分析。[4]

 

FUS基因突变已被确定为肌萎缩侧索硬化 (ALS)、特发性震颤和罕见形式的额颞叶变性 (FTLD) 的致病或危险因素。许多与ALS相关的突变位于FUS的C端核定位信号中,导致它位于细胞质中而不是细胞核中(野生型 FUS 主要位于此处)。虽然与ALS相关的突变基本没有“失活(Loss Function)”型的,但基因敲除小鼠仍然是我们研究这些基因功能和ALS深层机理的重要工具。

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参考文献:

1. Nolan M, Talbot K, Ansorge O. Pathogenesis of FUS-associated ALS and FTD: insights from rodent models. Acta Neuropathol Commun. 2016 Sep 6;4(1):99. doi: 10.1186/s40478-016-0358-8. PMID: 27600654; PMCID: PMC5011941.

2. Hicks GG, Singh N, Nashabi A, Mai S, Bozek G, Klewes L, Arapovic D, White EK, Koury MJ, Oltz EM, Van Kaer L, Ruley HE. Fus deficiency in mice results in defective B-lymphocyte development and activation, high levels of chromosomal instability and perinatal death. Nat Genet. 2000 Feb;24(2):175-9. doi: 10.1038/72842. PMID: 10655065.

3. Kuroda M, Sok J, Webb L, Baechtold H, Urano F, Yin Y, Chung P, de Rooij DG, Akhmedov A, Ashley T, Ron D. Male sterility and enhanced radiation sensitivity in TLS(-/-) mice. EMBO J. 2000 Feb 1;19(3):453-62. doi: 10.1093/emboj/19.3.453. PMID: 10654943; PMCID: PMC305582.

4. Kino Y, Washizu C, Kurosawa M, Yamada M, Miyazaki H, Akagi T, Hashikawa T, Doi H, Takumi T, Hicks GG, Hattori N, Shimogori T, Nukina N. FUS/TLS deficiency causes behavioral and pathological abnormalities distinct from amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathol Commun. 2015 Apr 25;3:24. doi: 10.1186/s40478-015-0202-6. PMID: 25907258; PMCID: PMC4408580.

 

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