如何提高异源蛋白表达量？密码子优化了解一下

我们在开展异源基因表达实验时，常常会遇到这样的问题，就是异源基因在宿主细胞中的蛋白表达量很低。疑惑的是所表达的蛋白既不是毒蛋白，且所用的也是强启动子，那为什么还会出现这种问题呢？这时候我们可以考虑是不是存在密码子偏好性的问题，可以通过密码子优化来提高异源基因在宿主细胞中的蛋白表达量。

什么是密码子的偏好性

密码子的偏好性是指不同生物在翻译过程中对简并密码子的使用频率存在差异，而在进化的过程中形成了一套与其相适应的常用密码子。蛋白质在翻译的过程中，是由tRNA转运氨基酸至核糖体中，mRNA中的三联体密码决定氨基酸序列（图1）。由于密码子存在简并性，因此同一种氨基酸可以由多个密码子编码。这意味着有61种可能的tRNA，而在生物体中都表达61种tRNA的可能性不高，并且每种tRNA的表达丰度也会存在差异。那当外源基因的密码子所对应的tRNA在宿主细胞中的表达量低时，则会影响它的翻译效率。

图1. 肽链的合成过程（Image from Mariana Ruiz Villarreal）

什么是密码子优化

密码子优化是通过基因工程技术，根据宿主的密码子偏好性调整基因的同义密码子，达到消除稀有密码子的目的，并且优化如mRNA二级结构和Motif等相关参数，从而提高翻译效率。当异源基因在宿主中无法有效表达时，可以考虑进行密码子优化，调整同义密码子和相关的调控元件，提高翻译效率。通过这种方法提高异源基因翻译效率的报道已经很多。如为了在人胚胎肾细胞（HEK293T）中提高重组猪白细胞介素-7（pIL-7）的表达，崔丹等依据人密码子的偏好对pIL-7基因进行了优化修饰，结果显示，密码子优化后pIL-7基因在HEK293T细胞中的表比野生型pIL-7基因的表达水平提高了2倍多，可见密码子优化可明显提高重组pIL-7在HEK293T细胞中的表达^[1]。

图2. 密码子优化型IL-7基因表达水平与其野生型基因的比较^[1]

密码子优化需考虑的因素

密码子优化需要综合考虑多种因素，才能取得良好的优化效果。不是简单地将外源基因的同义密码子调整为宿主细胞中表达丰度高、使用频率高的密码子就能提高蛋白的翻译效率，有时候效果往往会适得其反。因此密码子优化并不是一个简单的实验。下面我们介绍密码子优化时需要注意的主要因素：

1. 用宿主中最相似频率的同义密码子替换原序列密码子。如上述所言，生物体翻译过程中存在密码子的偏好性，若是在基因的同义密码子使用频率与表达宿主相匹配的情况下，蛋白的表达水平则会显著提高。匹配程度常用密码子适应指数 （Codon Adaption Index，CAI）来表示，通常情况下，CAI≥0.80被认为是预测重组蛋白高效表达的标准。并且在设计时要避免连续两个以上稀有密码子同时存在，否则很可能会导致翻译效率急剧降低，甚至可能会终止肽链的合成。

2. mRNA二级结构。mRNA的二级结构对翻译效率具有一定的影响。当mRNA因其序列而形成复杂稳定的二级结构时，会降低翻译效率。尤其是序列里有和核糖体结合位点或翻译起始位点互作的序列，会阻止翻译的进行，合理优化翻译起始区的mRNA二级结构，将有效提高目的蛋白表达水平。

3. 避开某些限制性酶切位点。在密码子优化时避免形成构建载体时所需要的酶切位点，以免酶切位点产生冲突，影响构建表达载体的操作。

4. GC含量要合适。GC含量能影响DNA的稳定性，间接影响基因的表达调控，当GC含量超过70%可能会降低蛋白的表达。

5. 调整Motif和剪切位点。如增强子、Shine-Dalgarno序列的特异核糖体结合序列、TATA box等顺式作用原件能促进或者抑制基因的表达量。因此调整相关Motif能提高蛋白的表达量。而去除内含子属性的剪接位点，也能提高蛋白表达成功率。

密码子优化的风险

密码子优化能够提高蛋白质的翻译效率，从而提高蛋白的表达量。但是改变密码子也可能产生潜在不利的影响，如密码子优化可能影响蛋白质的构象、折叠和稳定性等^[2]。核糖体在肽链延伸的过程中可能减慢速度，不过这是肽链以正确折叠的重要步骤^[3]。另外，不同的tRNA会影响翻译的效率，这就可能影响核糖体对肽链的加工时间。

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参考文献：

[1]崔丹, 温洁霞, 霍珊珊等. 密码子优化提高猪IL-7在HEK293T细胞表达的研究[J]. 河北农业大学学报, 2017, 第40卷（6）:88-92.

[2]Mauro, Vincent P., and Stephen A. Chappell. “A Critical Analysis of Codon Optimization in Human Therapeutics.” Trends in Molecular Medicine, vol. 20, no. 11, 2014, pp. 604–613.

[3]Stadler, Michael, and Andrew Fire. “Wobble Base-Pairing Slows in Vivo Translation Elongation in Metazoans.” RNA, vol. 17, no. 12, 2011, pp. 2063–2073.

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