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关于基因编辑细胞,看这篇就够了

基因编辑细胞

相信在科研上默默努力的小伙伴一定听过或被安利过CRISPR-Cas9基因编辑技术,小编在初次了解到这个技术时,感觉它太强大了!特别是在基因功能研究中,常常会用到CRISPR-Cas9技术,例如构建基因敲除、基因定点突变和基因敲入的细胞等,方便和高效的标签已经牢牢贴在它的身上。今天带大家一起回顾CRISPR-Cas9在细胞实验上的帮助吧!

 

1.基因敲除

基因敲除(Knock out,KO)是基因功能研究中的“减法”套路,也就是基因功能缺失的研究思路,当目的基因被敲除,基因功能丧失后,所出现的细胞表型变化我们便认为与该基因相关。同时,这个“减法”套路可以用RNAi技术在转录水平上实现,但RNAi技术的调控原理是靶向mRNA,与CRISPR-Cas9技术的KO在效果上存在差异。那么,下面给大家回顾一下整个敲除实验的流程和注意细节!

 

首先,使用CRISPR-Cas9进行敲除基因有两种策略——移码敲除和片段敲除。两种策略各有优缺点,需根据敲除细胞的类型和目的基因信息来综合选择。

 

设计合理有效的sgRNA是我们最终成功实现基因编辑的重要前提。这里需要注意的是要尽可能选择切割效率高效和特异性好的sgRNA,避免影响其他基因和脱靶等情况。悄悄告诉你:详细的设计技巧可看《sgRNA设计,你需要注意哪些问题》。

 

获取sgRNA后,我们需要将其和Cas9转导到细胞内,常用的方法有RNP法、质粒法和慢病毒法。三种方法都各具特点,RNP法简便、快捷和敲除效率较好;慢病毒法的敲除效率高,但存在影响其它基因和脱靶的风险;质粒法方便、简易,但效率较低。三种方法的详细对比可参考:《基因敲除,用质粒、病毒、还是……?》。

 

编辑过后的混合细胞池存在各种细胞类型,可通过稀释等方法获得单克隆细胞,然后再通过PCR和测序鉴定基因型,筛选目标基因型的单克隆。如果使用片段敲除的策略(敲除200bp以上),可通过PCR扩增敲除片段附近的区域,通过比较与野生型的电泳结果,能直观地知道敲除结果。当然也需要对扩增的PCR产物进行测序,进一步明确基因型。如果是移码突变策略,则需要扩增靶区域进行测序,明确基因型。详细的鉴定方法可参考:《我不允许还有人不知道怎么鉴定基因敲除细胞系》。

 

2.点突变、基因敲入

CRISPR-Cas9技术也可进行细胞的基因定点突变和敲入。在sgRNA和Cas9蛋白的基础上引入带有目的片段的Donor模板,启动细胞的同源重组修复机制,达到基因点突变或基因敲入。在开展实验时,需要注意的环节是sgRNA的设计、Donor模板的设计、细胞类型与生长状态和瞬转电压等。其中基因敲入细胞系的构建注意要点,可参考:《为什么都说基因敲入难?因为你忽视了这些》。

 

在开展点突变实验时,除了上述的方法外,还能使用以CRISPR-Cas9系统为基础的单碱基编辑器。单碱基编辑器包含sgRNA和融合蛋白两个部分。其中融合蛋白是由切割基因组能力大大降低的突变型Cas9(dead Cas9,dCas9或nickase Cas9,nCas9)和促碱基转换的分子融合而成。在sgRNA引导下,融合蛋白到特定的基因组位置上编辑指定的碱基。单碱基编辑器的详细介绍可参考:《不了解单碱基编辑系统?看这一篇就够啦》。

 

3.小结

CRISPR-Cas9系统具有高效、精准和方便等特点,在经过不断开发和改进,已经进化出多个应用于不同场景的版本,为我们的实验提供了极大的助力。各位同学根据实验需求,科学运用CRISPR-Cas9系统,注意实验细节,相信肯定能取得好的实验结果。

 

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赛业生物科技集团是一家基于模式动物药物研发的国际化创新性CRO平台。依托于品系丰富的基因编辑小鼠资源库、高效且智能化的模式动物定制平台、药物筛选评价小鼠模型平台、一站式小动物表型分析平台、一站式无菌鼠技术服务平台及先进的细胞技术服务平台,建立了多位一体的创新性CRO平台服务网络,以服务于肿瘤、免疫、代谢、内分泌、心血管、神经及传染病等方向的科学研究及药物研发筛选,并与全球100多个国家和地区的数万名科学家及企事业单位建立了广泛的合作,产品与技术已直接应用于包括CNS(Cell, Nature, Science)三大期刊在内的6200余篇学术论文。赛业生物已获得ISO9001:2015和AAALAC双认证,确保向广大专家学者提供的所有产品和技术服务符合国际标准的同时也表达了我们尊重动物福利和伦理,重视生物安全的负责任态度。 

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